极端微生物的生物勘探以解决环境污染问题

该协议描述了一种从地热泉中筛选和分离抗重金属微生物的简化方法。这种方法代表了全球对生物传感和生物修复领域应用越来越感兴趣的研究领域。其中描述的方法可以很容易地修改，以从不同的环境来源（例如水，食物，土壤或沉积物）中分离微生物。

鉴定耐药微生物的最小抑制浓度是表征新物种或菌株的快速策略。该协议易于执行，只需要手动技能和基本微生物学技术的经验。首先，将两克收集的样品接种到50微米新鲜制备的Luria-Bertani培养基中，pH值为4或7。

将此样品在采样部位的温度正负五摄氏度孵育。将200微升样品放在pH值为4或7的Luria-Bertani琼脂上，并将其保持在55或60摄氏度的静态状态下48小时。孵育后，分离单个菌落并重复此条纹电镀循环至少三次。

要制备一毫升冷冻细胞储备，向过夜生长的细胞中加入20%甘油。使用丙酮和干冰的混合物快速冷冻。为了从甘油储备中制备接种物，在50毫升的Luria-Bertani中接种50微升。

为了获得生长曲线，在10微升的Luria-Bertani中稀释这种预培养物。要将光密度调整到0.1，请添加600纳米。在眼眶振荡器中以55或60摄氏度培养这些细胞16小时。

以30分钟的间隔测量600纳米的光密度。根据此数据在X轴上的时间和Y轴上600纳米的光密度的曲线。绘制具有不同pH值的培养基的相似生长曲线，以确定实验室条件的最佳pH值，将从甘油储备中条纹的分离物接种在50微升的Luria-Bertani培养基中并孵育过夜。

将此过夜培养物以5， 000倍G离心10分钟，然后弃去上清液并收获培养盘。使用前立即制备10毫升由20毫摩尔Tris-HCL，2毫摩尔EDTA，1.2%Triton X-100和20毫克/毫升溶酶体组成的细菌裂解缓冲液。将沉淀重新悬浮在180微升的溶菌缓冲液中。

按照纯化试剂盒中的说明进行基因组DNA提取，并通过UV-Vis测量基因组DNA及其纯度。要评估纯度，请确定 260 至 280 和 260 至 230 的光密度比。通过在0.8%琼脂糖凝胶上加载每个样品的200纳克，并将尺寸分布与高度，重量分子标记物进行比较，评估基因组DNA的完整性。

在200毫升的Luria-Bertani最佳pH和温度条件下从甘油原液中生长分离物。在含有增加浓度的重金属和抗生素的50毫升聚丙烯管中，在5毫升的Luria-Bertani培养基中稀释每个预培养物，以在600纳米处获得0.1的光密度。在55或60摄氏度下以每分钟180转的速度在轨道振荡器上培养细胞16小时。

通过确定未发生微生物生长的试管中的浓度值来计算抗生素或重金属的最小抑制浓度。通过在Luria-Bertani琼脂平板上以最低抑制浓度生长的200微升培养物并验证过夜孵育后是否存在菌落，检查浓度是否对细胞具有抑制性且对细胞不致死。该方案用于测试来自Piscarelli地区的细菌样品，酸硫酸地热环境对分离微生物的表型表征表明，分离物对砷酸盐和钒酸盐具有较高的耐受性，并且对镉具有抗性。

比较数据表明，分离物对五价砷具有很强的抗性，而分离物对三价砷具有抗性。抗生素耐药性测试表明，即使使用低浓度，分离株对所有测试的抗生素也高度敏感。相反，分离株 2 对除氯霉素和四环素外的所有测试抗生素均耐药。

由于随机突变或水平基因转移，微生物可能已经获得抗生素耐药性，这在极端环境条件下代表了选择性优势。这项研究证明了这些方法在选择能够灭活污染物并将其转化为无害产品的环境微生物方面的有用性。