Протокол описывает упрощенный подход к скринингу и изоляции устойчивых к тяжелым металлам микробов из геотермальных источников. Этот подход представляет собой область исследований, представляющую растущий интерес во всем мире для применения в области биозондирования и биоремедиации. Описанный в нем способ может быть легко модифицирован для выделения микробов из различных источников окружающей среды, таких как вода, пища, почва или осадок.
Минимальная ингибирующая концентрация для идентификации резистентных микробов является быстрой стратегией для характеристики новых видов или штаммов. Этот протокол прост в выполнении и требует только ручных навыков и опыта работы с основными методами микробиологии. Для начала привить два грамма собранного образца в 50 микролитов свежеприготовленной среды Лурия-Бертани с рН четыре или семь.
Инкубируйте этот образец при температуре места отбора проб плюс-минус пять градусов Цельсия. Нанесите 200 микролитров образца на агар Лурии-Бертани с рН четыре или семь и держите его в статическом состоянии при 55 или 60 градусах Цельсия в течение 48 часов. После инкубации выделяют одиночные колонии и повторяют этот цикл покрытия полос не менее трех раз.
Чтобы приготовить один миллилитр замороженного клеточного материала, добавьте 20% глицерина в выращенные на ночь клетки. Используйте смесь ацетона и сухого льда для быстрой заморозки. Чтобы приготовить инокулят из глицеринового бульона, привить 50 микролитров в 50 миллилитрах Лурии-Бертани.
Чтобы получить профиль роста, разбавьте эту предварительную культуру в 10 микролитрах Лурии-Бертани. Для регулировки оптической плотности до 0,1 добавьте 600 нанометров. Выращивайте эти клетки в течение 16 часов при 55 или 60 градусах Цельсия в орбитальном шейкере.
Измерьте оптическую плотность на расстоянии 600 нанометров с интервалом в 30 минут. Кривая из этих данных со временем по оси X и оптической плотностью в 600 нанометров по оси Y. Постройте аналогичные кривые роста с изменяющимся рН питательной среды, чтобы определить оптимальный рН для лабораторных условий, инокулируют изолят, прочерченный из глицеринового запаса, в 50 микролитрах среды Луриа-Бертани и инкубируют в течение ночи.
Центрифугируйте эту выращенную на ночь культуру в течение 10 минут при 5000 G, затем выбросьте супернатант и соберите палитру культур. Непосредственно перед использованием готовят 10 миллилитров буфера лизиса бактерий, состоящего из 20 миллимоляров Tris-HCL, двух миллимоляров ЭДТА, 1,2% тритона X-100 и 20 миллиграммов на миллилитр лизосому. Повторно суспендируйте гранулу в 180 микролитрах буфера бактериального анализа.
Извлечение геномной ДНК в соответствии с инструкциями в наборе для очистки и измерение геномной ДНК и ее чистоты с помощью UV-Vis. Чтобы оценить чистоту, определите соотношения оптической плотности от 260 до 280 и от 260 до 230. Оцените целостность геномной ДНК, загрузив 200 нанограммов каждого образца на 0,8% агарозный гель и сравнив распределение размеров с молекулярным маркером роста, веса.
Выращивают изолят из глицеринового сырья в 200 миллилитрах Лурии-Бертани в оптимальных рН и температурных условиях. Разбавляют каждую предварительную культуру в пяти миллилитрах среды Луриа-Бертани в 50 миллилитрах полипропиленовых пробирок, содержащих возрастающие концентрации тяжелых металлов и антибиотиков для получения оптической плотности 0,1 при 600 нанометрах. Выращивайте клетки в течение 16 часов на орбитальном шейкере со скоростью 180 оборотов в минуту при 55 или 60 градусах Цельсия.
Рассчитайте минимальную ингибирующую концентрацию для антибиотиков или тяжелых металлов, определив значения концентрации в пробирках, где не происходит роста микробов. Проверьте, что концентрация является ингибирующей и не смертельной для клеток, покрыв 200 микролитров культуры, выращенной при минимальных ингибирующих концентрациях на агаровых пластинах Лурии-Бертани и проверив наличие колоний после ночной инкубации. Этот протокол был использован для тестирования бактериальных образцов из района Пискарелли, кислотной серной геотермальной среды Фенотипическая характеристика изолированных микроорганизмов показала, что изолят имеет более высокую толерантность к арсенату и ванадату и устойчив к кадмию.
Сравнительные данные свидетельствуют о том, что изолированный имеет сильную устойчивость к пятивалентному мышьяку, в то время как изолированный два имеет устойчивость к трехвалентному мышьяку. Тесты на устойчивость к антибиотикам показали, что изолятор очень чувствителен ко всем испытуемым антибиотикам даже при низких концентрациях. Напротив, изолят два устойчив ко всем протестированным антибиотикам, за исключением хлорамфеникола и тетрациклина.
Микроорганизм, вероятно, приобрел устойчивость к антибиотикам из-за случайных мутаций или горизонтального переноса генов, представляющего собой селективное преимущество в экстремальных условиях окружающей среды. Данное исследование демонстрирует полезность таких методов для отбора микроорганизмов окружающей среды, которые могут инактивировать загрязняющие вещества и превращать их в безвредные продукты.
