Das Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz für das Screening und die Isolierung einer schwermetallbeständigen Mikrobe aus geothermischen Quellen. Dieser Ansatz stellt ein Forschungsgebiet von wachsendem Interesse für Anwendungen im Bereich der Biosensorik und Bioremediation dar. Das darin beschriebene Verfahren kann leicht modifiziert werden, um Mikroben aus verschiedenen Umweltquellen wie Wasser, Nahrung, Boden oder Sediment zu isolieren.
Die minimale hemmende Konzentration zur Identifizierung resistenter Mikroben ist eine schnelle Strategie, um die neuen Spezies oder Stämme zu charakterisieren. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert nur manuelle Fähigkeiten und Erfahrung mit den grundlegenden mikrobiologischen Techniken. Impfen Sie zunächst zwei Gramm gesammelte Probe in 50 Mikroliter frisch zubereitetes Luria-Bertani-Medium mit einem pH-Wert von vier oder sieben.
Inkubieren Sie diese Probe bei der Temperatur der Probenahmestelle plus/minus fünf Grad Celsius. Beschichten Sie 200 Mikroliter der Probe auf Luria-Bertani-Agar mit einem pH-Wert von vier oder sieben und halten Sie sie 48 Stunden lang in einem statischen Zustand bei 55 oder 60 Grad Celsius. Isolieren Sie nach der Inkubation einzelne Kolonien und wiederholen Sie diesen Streifenplattierungszyklus mindestens dreimal.
Um einen Milliliter gefrorenen Zellstock herzustellen, fügen Sie 20% Glycerin zu über Nacht gewachsenen Zellen hinzu. Verwenden Sie eine Mischung aus Aceton und Trockeneis zum schnellen Einfrieren. Um ein Inokulum aus einem Glycerinvorrat herzustellen, impfen Sie 50 Mikroliter in 50 Millilitern Luria-Bertani.
Um ein Wachstumsprofil zu erhalten, verdünnen Sie diese Vorkultur in 10 Mikroliter Luria-Bertani. Um die optische Dichte auf 0,1 einzustellen, fügen Sie 600 Nanometer hinzu. Züchten Sie diese Zellen 16 Stunden lang bei 55 oder 60 Grad Celsius im Orbitalschüttler.
Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern in 30-Minuten-Intervallen. Kurve aus diesen Daten mit Zeit auf der X-Achse und optischer Dichte bei 600 Nanometern auf der Y-Achse. Zeichnen Sie ähnliche Wachstumskurven mit variierendem pH-Wert des Kulturmediums auf, um den optimalen pH-Wert für Laborbedingungen zu bestimmen, Inokkulieren Sie das aus dem Glycerinbestand gestreifte Isolat in 50 Mikrolitern Luria-Bertani-Medium und inkubieren Sie es über Nacht.
Zentrifugieren Sie diese über Nacht gewachsene Kultur für 10 Minuten bei 5.000 mal G, werfen Sie dann den Überstand weg und ernten Sie die Kulturpalette. Bereiten Sie 10 Milliliter Bakterienlysepuffer vor, der aus 20 millimolaren Tris-HCL, zwei millimolaren EDTA, 1,2% Triton X-100 und 20 Milligramm pro Milliliter Lysosom besteht, unmittelbar vor der Anwendung. Suspendieren Sie das Pellet in 180 Mikrolitern Bakterienlysepuffer erneut.
Genomische DNA-Extraktion wie im Reinigungskit angewiesen und Messung der genomischen DNA und ihrer Reinheit mittels UV-Vis. Um die Reinheit zu beurteilen, bestimmen Sie die optischen Dichteverhältnisse von 260 bis 280 und 260 bis 230. Bewerten Sie die Integrität der genomischen DNA, indem Sie 200 Nanogramm jeder Probe auf ein 0,8% Agarosegel laden und die Größenverteilung mit einem molekularen Marker für Größe und Gewicht vergleichen.
Züchten Sie das Isolat aus Glycerinbestand in 200 Millilitern Luria-Bertani optimalen pH- und Temperaturbedingungen. Verdünnen Sie jede Vorkultur in fünf Milliliter Luria-Bertani-Medium in 50 Milliliter Polypropylenröhrchen mit steigenden Konzentrationen von Schwermetallen und Antibiotika, um eine optische Dichte von 0,1 bei 600 Nanometern zu erhalten. Züchten Sie die Zellen 16 Stunden lang auf einem Orbitalschüttler mit 180 Umdrehungen pro Minute bei 55 oder 60 Grad Celsius.
Berechnen Sie die minimale Hemmkonzentration für Antibiotika oder Schwermetalle, indem Sie die Konzentrationswerte in den Röhrchen identifizieren, in denen kein mikrobielles Wachstum stattfindet. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration für die Zellen hemmend und nicht tödlich ist, indem Sie 200 Mikroliter der Kultur, die in minimalen hemmenden Konzentrationen auf Luria-Bertani-Agarplatten gezüchtet werden, plattieren und das Vorhandensein von Kolonien nach der Inkubation über Nacht überprüfen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Bakterienproben aus dem Piscarelli-Gebiet zu testen, eine saure schwefelige geothermale Umgebung Die phänotypische Charakterisierung der isolierten Mikroorganismen zeigte, dass Isolat eine höhere Toleranz gegenüber Arsenat und Vanadat aufweist und gegen Cadmium resistent ist.
Vergleichende Daten deuten darauf hin, dass Isolat eins eine starke Resistenz gegen pentavalentes Arsen hat, während Isolat zwei eine Resistenz gegen dreiwertiges Arsen hat. Antibiotikaresistenztests zeigten, dass Isolat One sehr empfindlich auf alle getesteten Antibiotika reagiert, selbst wenn niedrige Konzentrationen verwendet wurden. Im Gegensatz dazu ist Isolat zwei gegen alle getesteten Antibiotika mit Ausnahme von Chloramphenicol und Tetracyclin resistent.
Der Mikroorganismus hat wahrscheinlich eine Antibiotikaresistenz aufgrund zufälliger Mutationen oder eines horizontalen Gentransfers erworben, was einen selektiven Vorteil unter extremen Umweltbedingungen darstellt. Diese Studie zeigt die Nützlichkeit solcher Methoden, um Umweltmikroorganismen auszuwählen, die die Schadstoffe inaktivieren und in harmlose Produkte umwandeln können.
