הפרוטוקול מתאר גישה יעילה לסינון ובידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים. גישה זו מייצגת תחום מחקר בעל עניין הולך וגובר ברחבי העולם ליישום בתחום הביוסנסינג והביו-רמדיה. ניתן לשנות בקלות את השיטה המתוארת בו כדי לבודד מיקרובים ממקורות סביבתיים מגוונים כגון מים, מזון, אדמה או משקעים.
הריכוז המעכב המינימלי לזיהוי מיקרובים עמידים הוא אסטרטגיה מהירה לאפיון המינים או הזנים החדשים. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש רק מיומנות וניסיון ידניים בטכניקות המיקרוביולוגיה הבסיסיות. כדי להתחיל, לחסן שני גרם של דגימה שנאספה לתוך 50 microlites של מדיום Luria-Bertani מוכן טרי עם pH של ארבעה או שבעה.
דגירה של דגימה זו בטמפרטורה של אתר הדגימה פלוס או מינוס חמש מעלות צלזיוס. צלחת 200 microliters של הדגימה על לוריא-ברטאני אגר עם pH של ארבעה או שבעה ולשמור אותו במצב סטטי ב 55 או 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאחר הדגירה, בודדו מושבות בודדות וחזרו על מחזור ציפוי הפסים הזה לפחות שלוש פעמים.
כדי להכין מיליליטר אחד של מלאי תאים קפואים, הוסיפו 20% גליצרול לתאים שגדלו במשך הלילה. השתמשו בתערובת של אצטון וקרח יבש להקפאה מהירה. כדי להכין אינוקולום ממלאי גליצרול, חסן 50 מיקרוליטרים ב-50 מיליליטרים של לוריא-ברטאני.
כדי לקבל פרופיל צמיחה, דללו את הקדם-תרבית הזו ב-10 מיקרוליטרים של לוריא-ברטאני. כדי להתאים את הצפיפות האופטית ל- 0.1 הוסף 600 ננומטר. לגדל את התאים האלה במשך 16 שעות בטמפרטורה של 55 או 60 מעלות צלזיוס בשייקר המסלולי.
מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר במרווחים של 30 דקות. עקומה מנתונים אלה עם זמן על ציר X וצפיפות אופטית ב 600 ננומטר על ציר Y. הצב עקומות גדילה דומות עם pH משתנה של מדיום התרבית, כדי לקבוע את ה- pH האופטימלי לתנאי מעבדה, חסן את המבודד המפוספס ממלאי הגליצרול ב-50 מיקרוליטרים של מדיום לוריא-ברטאני ודגירה בן לילה.
צנטריפוגה זו תרבות גדלה בן לילה במשך 10 דקות ב 5, 000 פעמים G ואז להשליך את supernatant וקציר את לוח התרבית. הכן 10 מיליליטרים של חיידקים lysis buffer המורכב מ 20 millimolar Tris-HCL, שני מילימולאר EDTA, 1.2%Triton X-100 ו 20 מיליגרם למיליליטר ליזוזום מיד לפני השימוש. להשעות מחדש את הכדור ב-180 מיקרוליטרים של מאגר חיידקים.
מיצוי דנ"א גנומי כפי שהונחה בערכת הטיהור ומדידת דנ"א גנומי וטוהרו על ידי UV-Vis. כדי להעריך את הטוהר, קבע את יחסי הצפיפות האופטית של 260 עד 280 ו-260 עד 230. הערך את שלמות הדנ"א הגנומי על ידי העמסת 200 ננוגרם של כל דגימה על ג'ל אגרוז של 0.8% והשוואת התפלגות הגודל לסמן מולקולרי בגובה ובמשקל.
לגדל את הבידוד ממלאי הגליצרול ב-200 מיליליטרים של תנאי ה-pH והטמפרטורה האופטימליים של לוריא-ברטאני. דיללו כל קדם-תרבית בחמישה מיליליטרים של מדיום לוריא-ברטאני ב-50 מיליליטר של צינורות פוליפרופילן המכילים ריכוזים הולכים וגדלים של מתכות כבדות ואנטיביוטיקה כדי לקבל צפיפות אופטית של 0.1 ב-600 ננומטר. לגדל את התאים במשך 16 שעות על שייקר מסלולי עם 180 סיבובים לדקה ב 55 או 60 מעלות צלזיוס.
חשב את הריכוז המעכב המינימלי עבור אנטיביוטיקה או מתכות כבדות על ידי זיהוי ערכי הריכוז בצינורות שבהם לא מתרחשת צמיחה מיקרוביאלית. בדקו שהריכוז מעכב ולא קטלני עבור התאים על ידי ציפוי 200 מיקרוליטרים של התרבית שגדלו בריכוזים מעכבים מינימליים על צלחות אגר לוריא-ברטאני ואימות נוכחות של מושבות לאחר הדגירה של הלילה. פרוטוקול זה שימש לבדיקת דגימות חיידקים מאזור פיסקרלי, סביבה גיאותרמית של חומצה גופרתית אפיון פנוטיפי של המיקרואורגניזמים המבודדים הראה כי לבידוד יש עמידות גבוהה יותר לארסנאט וונדאט והוא עמיד בפני קדמיום.
נתונים השוואתיים מצביעים על כך שלבודד יש עמידות חזקה לארסן מחומש בעוד שלבודד שניים יש עמידות לארסן טריוולנטי. בדיקות עמידות לאנטיביוטיקה הראו כי אדם מבודד רגיש מאוד לכל האנטיביוטיקה שנבדקו גם כאשר נעשה שימוש בריכוזים נמוכים. לעומת זאת, לבודד שניים עמיד לכל האנטיביוטיקה שנבדקו למעט כלורמפניקול וטטרציקלין.
המיקרואורגניזם ככל הנראה רכש עמידות לאנטיביוטיקה עקב מוטציות אקראיות או העברת גנים אופקית המייצגים יתרון סלקטיבי בתנאים סביבתיים קיצוניים. מחקר זה מדגים את התועלת של שיטות כאלה לבחירת מיקרואורגניזם סביבתי שיכול להשבית את המזהמים ולהמיר אותם למוצרים לא מזיקים.
