이 프로토콜은 지열 스프링스에서 중금속 내성 미생물을 선별하고 분리하기위한 간소화 된 접근법을 설명합니다. 이 접근법은 바이오 감지 및 생물 치료 분야에 적용하기 위해 전 세계적으로 관심이 높아지고 있는 연구 영역을 나타냅니다. 그 안에 기술된 방법은 물, 음식, 토양 또는 퇴적물과 같은 다양한 환경 공급원으로부터 미생물을 분리하도록 쉽게 변형될 수 있다.
내성 미생물을 확인하기 위한 최소 억제 농도는 새로운 종 또는 균주를 특성화하는 빠른 전략이다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 기본 미생물학 기술에 대한 수동 기술과 경험 만 있으면됩니다. 시작하려면, 수집 된 샘플 두 그램을 갓 준비된 Luria-Bertani 배지의 50 마이크로 라이트에 네 개 또는 일곱 개의 pH로 접종하십시오.
이 샘플을 샘플링 부위의 온도 플러스 또는 영하 섭씨 다섯 도에서 배양하십시오. 샘플 200 마이크로리터를 4 또는 일곱 개의 pH로 Luria-Bertani 한천에 플레이트하고 48시간 동안 섭씨 55도 또는 60도에서 정적 상태로 유지한다. 인큐베이션 후, 단일 콜로니를 분리하고, 이러한 줄무늬 도금 사이클을 적어도 세 번 반복한다.
한 밀리리터의 냉동 세포 스톡을 준비하려면 밤새 성장한 세포에 20% 글리세롤을 첨가하십시오. 빠른 동결을 위해 아세톤과 드라이 아이스의 혼합물을 사용하십시오. 글리세롤 스톡에서 접종물을 준비하려면 Luria-Bertani 50 밀리리터에 50 마이크로 리터를 접종하십시오.
성장 프로파일을 얻으려면, 이 예비 배양물을 10 마이크로리터의 루리아-베르타니에 희석한다. 광학 밀도를 0.1로 조정하려면 600 나노 미터를 추가하십시오. 이 세포를 오비탈 쉐이커에서 섭씨 55도 또는 60도에서 16 시간 동안 성장시킵니다.
30분 간격으로 600나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. X 축의 시간과 Y 축의 600 나노 미터에서의 광학 밀도에 따라이 데이터로부터의 곡선. 배양 배지의 다양한 pH와 유사한 성장 곡선을 플롯하고, 실험실 조건에 대한 최적 pH를 결정하기 위해, 글리세롤 스톡으로부터 줄무늬가 있는 단리물을 50 마이크로리터의 Luria-Bertani 배지에 접종하고 밤새 배양한다.
이렇게 하룻밤 동안 성장한 배양물을 5, 000배 G에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 버리고 배양 팔레트를 수확한다. 사용 직전에 20 밀리몰 Tris-HCL, 2 밀리몰 EDTA, 1.2 % Triton X-100 및 밀리리터 리소좀 당 20 밀리그램으로 구성된 박테리아 용해 완충액 10 밀리리터를 준비하십시오. 펠렛을 180 마이크로리터의 박테리아 용해 완충액에 재현탁시킨다.
정제 키트에서 지시된 대로 게놈 DNA 추출 및 UV-Vis에 의해 게놈 DNA 및 그의 순도를 측정한다. 순도를 평가하려면 260 ~ 280 및 260 ~ 230의 광학 밀도 비율을 결정하십시오. 각 샘플의 200 나노그램을 0.8% 아가로스 겔에 로딩하고 크기 분포를 높이, 중량 분자 마커와 비교하여 게놈 DNA의 완전성을 평가한다.
글리세롤 스톡으로부터 분리물을 200 밀리리터의 Luria-Bertani 최적 pH 및 온도 조건에서 성장시킨다. 각 예비 배양물을 5 밀리리터의 Luria-Bertani 배지에 희석하여 중금속 및 항생제의 농도를 증가시키는 폴리프로필렌 튜브 50 밀리리터에 희석하여 600 나노미터에서 0.1의 광학 밀도를 얻는다. 섭씨 55도 또는 60도에서 분당 180 회전으로 궤도 쉐이커에서 16 시간 동안 세포를 성장시킵니다.
미생물 성장이 일어나지 않는 튜브의 농도 값을 확인하여 항생제 또는 중금속에 대한 최소 억제 농도를 계산하십시오. 최소 억제 농도로 성장한 배양물 200 마이크로리터를 Luria-Bertani 한천 플레이트에 플레이팅하고 밤새 배양 후 콜로니의 존재를 검증함으로써 세포에 대한 농도가 억제되고 치명적이지 않은지 확인하였다. 이 프로토콜은 피스카렐리 지역으로부터의 박테리아 샘플을 시험하기 위해 사용되었고, 산성 황산 지열 환경 분리된 미생물의 표현형 특성화는 단리된 것이 비소 및 바나데이트에 대해 더 높은 내성을 가지며 카드뮴에 내성이 있음을 보여주었다.
비교 데이터는 분리 하나가 오가 비소에 강한 저항력을 갖는 반면, 두 개의 분리는 삼가 비소에 대한 내성을 갖는다는 것을 시사한다. 항생제 내성 테스트는 낮은 농도가 사용 된 경우에도 시험 된 모든 항생제에 매우 민감하다는 것을 보여주었습니다. 대조적으로, 두 가지를 분리하는 것은 클로람페니콜과 테트라 사이클린을 제외한 모든 항생제에 내성이 있습니다.
미생물은 아마도 극한의 환경 조건에서 선택적 이점을 나타내는 무작위 돌연변이 또는 수평 유전자 전달로 인해 항생제 내성을 획득했을 것입니다. 이 연구는 오염 물질을 비활성화하고 무해한 제품으로 전환 할 수있는 환경 미생물을 선택하는 이러한 방법의 유용성을 보여줍니다.
