O protocolo descreve uma abordagem simplificada para a triagem e isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de Fontes geotérmicas. Essa abordagem representa uma área de pesquisa de crescente interesse mundial pela aplicação no campo da biosensação e bioremediação. O método descrito pode ser facilmente modificado para isolar micróbios de diversas fontes ambientais, como água, alimentos, solo ou sedimentos.
A concentração inibitória mínima para identificar micróbios resistentes é uma estratégia rápida para caracterizar as novas espécies ou cepas. Este protocolo é fácil de executar e requer apenas habilidade manual e experiência com as técnicas básicas de microbiologia. Para começar, inocular dois gramas de amostra coletada em 50 microlitos de médium Luria-Bertani recém-preparado com um pH de quatro ou sete.
Incubar esta amostra na temperatura do local de amostragem mais ou menos cinco graus Celsius. Placa 200 microliters da amostra em ágar Luria-Bertani com um pH de quatro ou sete e mantê-lo em uma condição estática a 55 ou 60 graus Celsius por 48 horas. Após a incubação, isole colônias únicas e repita este ciclo de chapeamento de raia pelo menos três vezes.
Para preparar um mililitro de estoque celular congelado, adicione 20% de glicerol às células cultivadas durante a noite. Use uma mistura de acetona e gelo seco para congelamento rápido. Para preparar um inóculo de um estoque de glicerol, inocular 50 microliters em 50 mililitros de Luria-Bertani.
Para obter um perfil de crescimento, dilui essa pré-cultura em 10 microliters de Luria-Bertani. Para ajustar a densidade óptica para 0,1 adicione 600 nanômetros. Cresça essas células por 16 horas a 55 ou 60 graus Celsius no agitador orbital.
Meça a densidade óptica em 600 nanômetros em intervalos de 30 minutos. Curva a partir deste dado com tempo no eixo X e densidade óptica a 600 nanômetros no eixo Y. Traçar curvas de crescimento semelhantes com pH variado do meio de cultura, para determinar o pH ideal para condições laboratoriais, Inocular o isolado listrado do estoque de glicerol em 50 microlitres de luria-bertani médio e incubar durante a noite.
Centrifugar essa cultura cultivada durante a noite por 10 minutos a 5.000 vezes G, em seguida, descartar o supernaspeuta e colher a paleta de cultura. Prepare 10 mililitros de tampão de lise bacteriana composto por 20 milimerlares Tris-HCL, dois milimônios EDTA, 1,2% Triton X-100 e 20 miligramas por mililitro lysosome imediatamente antes do uso. Suspenda a pelota em 180 microliters de tampão de bactérias.
Extração genômica de DNA como instruído no kit de purificação e medir DNA genômico e sua pureza por UV-Vis. Para avaliar a pureza, determine as razões de densidade óptica de 260 a 280 e 260 a 230. Avalie a integridade do DNA genômico carregando 200 nanogramas de cada amostra em um gel de 0,8% de agarose e comparando a distribuição de tamanho a uma altura, marcador molecular de peso.
Cresça o isolado do estoque de glicerol em 200 mililitros de Luria-Bertani para o pH ideal e condições de temperatura. Diluir cada pré-cultura em cinco mililitros de médium Luria-Bertani em 50 mililitros de tubos de polipropileno contendo concentrações crescentes de metais pesados e antibióticos para obter uma densidade óptica de 0,1 a 600 nanômetros. Cresça as células por 16 horas em um agitador orbital com 180 revoluções por minuto a 55 ou 60 graus Celsius.
Calcule a concentração inibitória mínima para antibióticos ou metais pesados identificando os valores de concentração nos tubos onde o crescimento microbiano não ocorre. Verifique se a concentração é inibitória e não letal para as células, emplacando 200 microliters da cultura cultivadas em concentrações inibitórias mínimas em placas de ágar Luria-Bertani e verificando a presença de colônias após a incubação noturna. Este protocolo foi utilizado para testar amostras bacterianas da área de Piscarelli, um ambiente geotérmico sulfúrico ácido Caracterização fenoplica dos microrganismos isolados mostrou que o isolado tem maior tolerância ao arsenato e vanadate e é resistente ao cádmio.
Dados comparativos sugerem que o isolado tem uma forte resistência ao arsênico pentavalente, enquanto o isolado dois tem resistência ao arsênico trivalente. Testes de resistência a antibióticos mostraram que o isolado é altamente sensível a todos os antibióticos testados, mesmo quando baixas concentrações foram usadas. Em contraste, o isolado dois é resistente a todos os antibióticos testados, exceto clorofenicol e tetraciclina.
O microrganismo provavelmente adquiriu resistência a antibióticos devido a mutações aleatórias ou transferência de genes horizontais representando uma vantagem seletiva em condições ambientais extremas. Este estudo demonstra a utilidade desses métodos para selecionar microrganismos ambientais que podem inativar os poluentes e convertê-los em produtos inofensivos.
