由于用于研究EGFR-整合素串扰及其对电池机械力的影响的TGT传感器平台的简单性，该协议具有重要意义。Rao概述了研究EGF依赖性调节的细胞力学。该方案适用于不同的配体，细胞类型，刺激范式，并且可以与具有不同张力阈值的TGT耦合。
表面合成起初似乎令人生畏。关键是要做好准备和组织，通过采用试剂制备和计算清单来精确执行复杂的步骤。在第一天，将多达八个25毫米玻璃盖放入聚四氟乙烯架中。
将机架放入含有40毫升200防乙醇的50毫升硼硅酸盐烧杯中。在室温下以35千赫兹的工作频率超声处理10至15分钟。在50毫升的烧杯中填充40毫升的食人鱼溶液，这是通过将硫酸和过氧化氢以3:1的比例在Pyrex烧杯中混合并用玻璃移液管搅拌而新鲜制备的。
将盖玻片架转移到烧杯中，并在通风橱中室温下孵育30分钟，以蚀刻盖板滑盖表面。蚀刻后，将盖玻片架转移到装有超纯水的烧杯中，并用镊子。目视检查盖玻片，以确保表面看起来干净，玻璃表面上没有图案或灰尘颗粒。
将盖玻片架转移到装有200防乙醇的烧杯上，洗涤两次，持续15秒，使表面平衡至有机溶剂。将盖玻片架转移到具有3%APTES的200防乙醇溶液中，在室温下放置一小时，以使盖玻片硅烷化。将机架浸入装有200度乙醇溶液的干净烧杯中。
使用低出口压力的氮气干燥盖玻片。将盖子滑入10厘米的聚苯乙烯培养皿中，其中有一块平坦的parrafin薄膜。在DMSO中加入100微升每毫升NHS生物素溶液两毫克到放置在石蜡膜上的四个盖玻片中。
将其他四个盖玻片放在顶部，两个盖玻片彼此相对，中间有功能化解决方案。在第二天，将盘子从四摄氏度中取出，并将夹层的盖子滑落分开。在分离三明治时，避免刮擦或损坏功能化表面。
然后，将盖玻片定向到机架中，涂层表面彼此相对。用氮气干燥。将盖玻片放入新盘子中，里面有一层帕拉芬薄膜。
在每个盖玻片中加入 800 微升 0.1% 牛血清白蛋白（1X PBS）。将盖玻片在室温下孵育30分钟，以使表面钝化并阻断后续功能化试剂的非特异性结合。为了使盖玻片功能化，在室温下在1X PBS中加入800微升每毫升1微克链霉亲和素45至60分钟。
使用热循环仪将TGT探针组装在PCR管中。孵育后，用1X PBS清洗盖玻片三次。将100微升预组装的TGT探头添加到四个盖玻片中，并使用剩余的四个盖玻片制作三明治，功能化的一面朝向探头。
盖上铝箔。孵育后，将三明治分开，并用1X PBS清洗盖玻片三次。小心地将盖玻片组装到预清洁的成像室中。
为了研究表皮生长因子刺激对Cos-7力学，粘附和细胞扩散的影响，用0.05%胰蛋白酶-EDTA对Cos-7细胞进行两分钟。通过用HBSS洗涤并在800G下离心五分钟来中和胰蛋白酶。在DMEM中组装的TGT表面上以40， 000个细胞密度的板状细胞，补充50纳克/毫升EGF或不含EGF的DMEM。
孵育后，用1X PBS洗涤细胞三次。用两毫升4%多聚甲醛在室温下固定12分钟。在室温下，用 1X PBS 每隔 5 分钟清洗一次盖板。
可选地，将盖玻片与50毫摩尔氯化铵在1X PBS中在37摄氏度下孵育30分钟。加入缓冲液A，并将带有盖玻片的成像室放入湿度容器中。在37摄氏度下孵育30分钟以阻断和渗透细胞。
在封闭缓冲液中以1:250稀释度稀释原代抗帕西林抗体。在每个覆盖玻片下与200微升一抗溶液一起在37摄氏度下孵育两小时。用双偶联山羊/抗兔二抗的混合物以1:800稀释度和双偶联鬼菁素的混合物以1:400稀释度同时标记细胞，每个覆盖滑移200微升的封闭缓冲液。
用1X PBS以五分钟的间隔洗涤表面五次。首先，向物镜中加入油，清洁样品室的盖玻片底部，然后将样品放在载物台上。专注于细胞并吸引完美的焦点。
通过关闭落射照明光圈光圈并使之居中来对齐RICM。将488纳米激光聚焦到房间天花板上的一个小点上，并增加入射角直至超过临界角，同时以实时模式监控摄像机上的荧光。观察背景荧光的急剧减少和超过临界角时单个聚焦平面。
使用RISM的相机的实时模式识别细胞以进行成像。在488纳米激发时获取肌动蛋白的RICM和TIRF图像，在561纳米激发时获得积分素张力，在647纳米激发时获取paxillin。使用 200 毫秒的曝光时间按顺序获取图像。
更改封面滑移，对焦并重复。将Cos-7细胞接种在该TGT表面上，有或没有EGF刺激，以研究配体刺激的EGFR活化对整合素力学的影响。如果整合素结合配体并施加大于探针张力阈值总和的力，则DNA双链体将分离，导致荧光。
任何机械力未破裂的TGT探针都将保持非荧光。将细胞与或不伴有EGF在TGT表面孵育60分钟，固定并免疫染色以显示局灶性粘附分布和细胞骨架的组织。在RICM图像中，与无刺激相比，EGF刺激显着增强了56-微牛顿TGT表面上的Cos-7细胞扩散。
EGF的刺激导致更循环的形态，代表Cos-7细胞扩散和生长。在EGF刺激下，来自开放探针的荧光也更高，如张力荧光图像中观察到的那样。EGF刺激下与开放探头数量成正比的开放探头的综合强度远高于无刺激。
始终记住盖子滑动的方向，保持功能化表面朝上。分离三明治时，请保持温和，以免表面划伤或损坏。在表面合成之后，可以探究调节细胞粘附或机械转导的细胞质蛋白。
这允许识别参与在质膜上协调细胞力学的下游信号分子。
