Bu protokol, EGFR-integrin çapraz konuşmasını incelemek için kullanılan TGT sensör platformunun basitliği ve hücre mekanik kuvvetleri üzerindeki etkisi nedeniyle önemlidir. Rao, hücre mekaniğinin EGF'ye bağımlı düzenlemesini araştırmak için özetlendi. Protokol farklı ligandlar, hücre tipleri, stimülasyon paradigmaları için uyarlanabilir ve değişen gerilim eşiklerine sahip TGT'lerle birleştirilebilir.
Yüzey sentezi ilk başta korkutucu görünebilir. Anahtar, reaktif hazırlama ve hesaplamalar için bir kontrol listesi kullanarak karmaşık adımları tam olarak yürütmek için hazırlanmak ve organize olmaktır. İlk gün, sekiz adede kadar 25 milimetrelik cam kapak kapağını politetrafloroetilen bir rafa yerleştirin.
Rafı, 40 mililitre 200 geçirmez etanol içeren 50 mililitrelik bir borosilikat beherine yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca 35 kilohertz çalışma frekansında sonikasyon. 50 mililitrelik bir beheri, sülfürik asit ve hidrojen peroksitin bir Pyrex kabında 3: 1 oranında karıştırılması ve bir cam pipetle karıştırılmasıyla taze hazırlanmış 40 mililitre piranha çözeltisi ile doldurun.
Kapak kayma rafını beherin içine aktarın ve kapak kayma yüzeyini kazımak için duman davlumbazındaki oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşındırmadan sonra, kapak kayma rafını cımbızla ultra saf su içeren bir beher'e aktarın. Cam yüzeyde desen veya toz parçacığı olmadan yüzeylerin temiz görünmesini sağlamak için kapak kaymalarını görsel olarak inceleyin.
Kapak kayma rafını 200 geçirmez etanol içeren bir beher'e aktarın ve yüzeyleri organik çözücüye dengelemek için 15 saniye boyunca iki kez yıkayın. Kapak kayma rafını, kapak fişlerini silalize etmek için oda sıcaklığında bir saat boyunca% 3 APTES ile 200 geçirmez etanol çözeltisine aktarın. Rafı 200 geçirmez etanol çözeltisine sahip temiz bir beherin içine daldırın.
Düşük çıkış basıncına sahip azot gazı kullanarak kapak kaymalarını kurulayın. Kapak kaymalarını, içine düz bir şekilde yerleştirilmiş bir parça parrafin filmi ile 10 santimetrelik polistiren bir kaba yerleştirin. DMSO'daki mililitre NHS-biyotin çözeltisi başına 100 mikrolitre iki miligram, parafin film üzerine yerleştirilmiş dört kapak kapağına ekleyin.
Diğer dört kapak fişi üstte, iki kapak fişi birbirine bakacak şekilde bir sandviç yerleştirin ve aralarında işlevsellik çözümü bulunur. İkinci günde, tabağı dört santigrat dereceden çıkarın ve sandviçlenmiş kapak fişlerini ayırın. Sandviçi ayırırken işlevselleştirilmiş yüzeyi çizmekten veya zarar vermekten kaçının.
Ardından, kapak kaymalarını rafta kaplanmış yüzey birbirine bakacak şekilde yönlendirin. Azot gazı ile kurulayın. Kapak fişlerini içinde parrafin filmi olan yeni bir kaba yerleştirin.
Her kapak kaymasına 1X PBS'de 800 mikrolitre% 0.1 sığır serum albümini ekleyin. Yüzeyi pasifize etmek ve sonraki işlevselleştirme reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için kapak kaymalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Kapak fişlerini işlevselleştirmek için, oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika boyunca 1X PBS'de mililitre streptavidin başına 800 mikrolitre bir mikrogram ekleyin.
TGT problarını bir termosiklet kullanarak bir PCR tüpüne monte edin. Kuluçkadan sonra, kapak kaymalarını 1X PBS ile üç kez yıkayın. Dört kapak fişine önceden monte edilmiş TGT problarından 100 mikrolitre ekleyin ve işlevselleştirilmiş tarafı problara bakacak şekilde kalan dört kapak fişini kullanarak sandviç yapın.
Alüminyum folyo ile örtün. Kuluçkadan sonra, sandviçleri ayırın ve kapak fişlerini 1X PBS ile üç kez yıkayın. Kapak kaymalarını önceden temizlenmiş görüntüleme odalarına dikkatlice monte edin.
Epidermal büyüme faktörü stimülasyonunun Cos-7 mekaniği, adezyonu ve hücre yayılımı üzerindeki etkisini araştırmak için, Cos-7 hücrelerini iki dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsisinize edin. HBSS ile yıkayarak ve beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yaparak tripsini nötralize edin. DMEM'deki monte edilmiş TGT yüzeylerinde 40.000 hücre yoğunluğundaki plaka hücreleri, mililitre başına 50 nanogram EGF veya EGF'siz DMEM ile desteklenir.
Kuluçkayı takiben, hücreleri 1X PBS ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca iki mililitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Kapak fişlerini oda sıcaklığında beş dakikalık aralıklarla 1X PBS ile beş kez yıkayın.
İsteğe bağlı olarak, kapak kaymalarını 1X PBS'de 50 milimolar amonyum klorür ile 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Tampon A ekleyin ve kapak kaymaları olan görüntüleme odalarını bir nem kabına yerleştirin. Hücreleri bloke etmek ve geçirgenleştirmek için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Primer anti-paxillin antikorunu bloke edici tamponda 1:250 seyreltmede seyreltin. 37 santigrat derecede iki saat boyunca kapak kayması başına 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ile inkübe edin. Hücreleri, 1:800 seyreltmede di-konjuge keçi / anti-tavşan sekonder antikoru ve kapak kayması başına 200 mikrolitre bloke tamponunda 1:400 seyreltmede di-konjuge faloidin karışımı ile eşzamanlı olarak etiketleyin.
Yüzeyleri beş dakikalık aralıklarla 1X PBS ile beş kez yıkayın. Başlamak için, hedefe yağ ekleyin, numune odasının kapak kayma tabanını temizleyin ve numuneyi sahneye yerleştirin. Bir hücreye odaklanın ve mükemmel odağı kullanın.
Epi-aydınlatma diyafram diyaframını kapatıp ortalayarak RICM'yi hizalayın. 488 nanometrelik lazeri odanın tavanındaki küçük bir noktaya odaklayın ve canlı modda kameradaki floresanı izlerken kritik açıyı geçene kadar insidans açısını artırın. Arka plan floresansında keskin bir azalma ve kritik açı aşıldığında tek bir odak düzlemi gözlemleyin.
RICM kullanarak kameranın canlı modunu kullanarak görüntüleme için hücreleri tanımlayın. 488 nanometre uyarımında aktinin, 561 nanometre uyarımında integrin geriliminin ve 647 nanometre uyarımında paxillinin RICM ve TIRF görüntülerini elde edin. 200 milisaniyelik pozlama süresini kullanarak görüntüleri sırayla elde edin.
Kapak kaymalarını değiştirin, odaklanın ve tekrarlayın. Cos-7 hücreleri, ligand stimülasyonu ile EGFR aktivasyonunun integrin mekaniği üzerindeki etkisini incelemek için bu TGT yüzeyine EGF stimülasyonu ile veya EGF stimülasyonu olmadan kaplandı. Bir integrin ligandı bağlarsa ve probun gerilim eşiği toplamından daha büyük bir kuvvet uygularsa, DNA dubleks ayrılır ve floresana yol açar.
Mekanik bir kuvvetin yırtılmadığı herhangi bir TGT probu, floresan olmayan olarak kalacaktır. Hücreler, TGT yüzeylerinde 60 dakika boyunca EGF ile veya EGF'siz olarak inkübe edildi, fokal adezyon dağılımını ve sitoiskeletin organizasyonunu göstermek için sabitlendi ve immünoboyalandı. RICM görüntüsünde, 56-pikonewton TGT yüzeyinde yayılan Cos-7 hücresi, stimülasyon olmadan karşılaştırıldığında EGF stimülasyonu ile anlamlı derecede artmıştır.
EGF ile stimülasyon, Cos-7 hücresinin yayılmasını ve büyümesini temsil eden daha dairesel bir morfoloji ile sonuçlandı. Açık problardan gelen floresan, gerilim floresan görüntüsünde gözlendiği gibi, EGF stimülasyonu ile de daha yüksektir. Açık probların sayısıyla orantılı olarak açık probların entegre yoğunluğu, EGF stimülasyonu ile stimülasyon olmadan çok daha yüksekti.
İşlevselleştirilmiş yüzeyi yukarı bakacak şekilde tutarak kapak kaymalarının yönünü her zaman hatırlayın. Sandviçi ayırırken, yüzeyin çizilmemesi veya hasar görmemesi için nazik olun. Yüzey sentezini takiben, hücre yapışmasını veya mekanik transdüksiyonu düzenleyen sitoplazmik proteinler için prob yapılabilir.
Bu, plazma zarındaki hücre mekaniğinin düzenlenmesinde rol oynayan aşağı akış sinyal moleküllerinin tanımlanmasına izin verir.
