هذا البروتوكول مهم بسبب بساطة منصة استشعار TGT المستخدمة لدراسة المحادثة المتقاطعة EGFR-integrin وتأثيرها على القوى الميكانيكية للخلايا. حدد راو الخطوط العريضة للتحقيق في التنظيم المعتمد على EGF لميكانيكا الخلايا. البروتوكول قابل للتكيف مع مختلف الأربطة ، وأنواع الخلايا ، ونماذج التحفيز ، ويمكن أن يقترن ب TGTs ذات عتبات التوتر المختلفة.
قد يبدو التوليف السطحي مخيفا في البداية. المفتاح هو أن تكون مستعدا ومنظما لتنفيذ الخطوات المعقدة بدقة من خلال استخدام قائمة مرجعية لإعداد الكاشف والحسابات. في اليوم الأول ، ضع ما يصل إلى ثمانية أغطية زجاجية مقاس 25 ملم في رف متعدد التترافلورو إيثيلين.
ضع الرف في كوب بورسليكات سعة 50 ملليلتر يحتوي على 40 ملليلتر من الإيثانول المقاوم ل 200 ملليلتر. سونيك عند تردد تشغيل 35 كيلو هرتز لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. املأ دورقا سعة 50 ملليلتر ب 40 ملليلتر من محلول البيرانا المحضر حديثا عن طريق خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3: 1 في كوب Pyrex وتحريكه باستخدام ماصة زجاجية.
انقل رف انزلاق الغطاء إلى الكأس واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان لحفر سطح انزلاق الغطاء. بعد الحفر ، انقل رف انزلاق الغطاء إلى كوب بماء فائق النقاء مع ملاقط. افحص انزلاقات الغطاء بصريا للتأكد من أن الأسطح تبدو نظيفة بدون أنماط أو جزيئات غبار على السطح الزجاجي.
انقل رف انزلاق الغطاء إلى كوب به إيثانول مقاوم ل 200 وغسله مرتين لمدة 15 ثانية لموازنة الأسطح مع المذيبات العضوية. انقل رف انزلاق الغطاء إلى محلول إيثانول مقاوم ل 200 مع 3٪ APTES لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لإضفاء الطابع على انزلاقات الغطاء. اغمر الرف في كوب نظيف بمحلول إيثانول مقاوم ل 200 شخص.
جفف انزلاقات الغطاء باستخدام غاز النيتروجين مع انخفاض ضغط الخروج. ضع الغطاء في طبق بوليسترين بطول 10 سنتيمترات مع قطعة من فيلم البارافين موضوعة بشكل مسطح بداخله. أضف 100 ميكرولتر من ملليغرام لكل ملليلتر من محلول NHS-biotin في DMSO إلى أربع شرائح غطاء موضوعة على فيلم البارافين.
ضع شطيرة مع زلات الغطاء الأربعة الأخرى في الأعلى ، مع وجود زلتين للغطاء متجهتين نحو بعضهما البعض مع حل التشغيل الوظيفي بينهما. في اليوم الثاني ، قم بإزالة الطبق من أربع درجات مئوية وافصل زلات الغطاء المحصورة. تجنب خدش أو إتلاف السطح الوظيفي أثناء فصل الشطيرة.
ثم ، قم بتوجيه الغطاء في الحامل بحيث يواجه السطح المطلي بعضه البعض. يجف بغاز النيتروجين. ضع الغطاء في طبق جديد مع فيلم بارافين بداخله.
أضف 800 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر بنسبة 0.1٪ في 1X PBS إلى كل شريحة غطاء. احتضن الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتخميل السطح ومنع الربط غير المحدد لكواشف التشغيل اللاحقة. لتشغيل انزلاقات الغطاء ، أضف 800 ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الستربتافيدين في 1X PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة.
قم بتجميع مجسات TGT في أنبوب PCR باستخدام جهاز تدوير حراري. بعد الحضانة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. أضف 100 ميكرولتر من مجسات TGT المجمعة مسبقا إلى أربع زلات تغطية واصنع السندويشات باستخدام زلات الغطاء الأربعة المتبقية مع الجانب الوظيفي المواجه للمجسات.
تغطية مع رقائق الألومنيوم. بعد الحضانة ، افصل السندويشات واغسل زلات الغطاء باستخدام 1X PBS ثلاث مرات. قم بتجميع الغطاء بعناية في غرف تصوير تم تنظيفها مسبقا.
للتحقيق في تأثير تحفيز عامل نمو البشرة على ميكانيكا Cos-7 ، والالتصاق ، وانتشار الخلايا ، التربسين خلايا Cos-7 مع 0.05 ٪ من التربسين-EDTA لمدة دقيقتين. قم بتحييد التربسين عن طريق الغسيل باستخدام HBSS والطرد المركزي عند 800 جم لمدة خمس دقائق. خلايا صفيحية بكثافة 40،000 خلية على أسطح TGT المجمعة في DMEM تستكمل ب 50 نانوغرام لكل ملليلتر EGF أو DMEM بدون EGF.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. إصلاح مع اثنين ملليلتر من 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغطاء خمس مرات باستخدام 1X PBS على فترات زمنية مدتها خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
اختياريا ، احتضن الغطاء مع كلوريد الأمونيوم 50 ملليمولار في 1X PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف المخزن المؤقت A وضع غرف التصوير مع انزلاقات الغطاء في حاوية الرطوبة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية لمنع وتخلل الخلايا.
تمييع الجسم المضاد الأساسي المضاد للباكسيلين عند 1:250 تخفيف في المخزن المؤقت المانع. احتضان مع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل زلة غطاء لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. قم بتسمية الخلايا في وقت واحد مع مزيج من الماعز ثنائي الاقتران / الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب عند 1:800 تخفيف و phalloidin ثنائي الاقتران في 1:400 تخفيف في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لكل زلة غطاء.
اغسل الأسطح خمس مرات باستخدام 1X PBS على فترات زمنية مدتها خمس دقائق. للبدء ، أضف الزيت إلى الهدف ، ونظف الجزء السفلي من غرفة العينة ، وضع العينة على المسرح. ركز على الخلية وشارك في التركيز المثالي.
قم بمحاذاة RICM عن طريق إغلاق وتوسيط الحجاب الحاجز لفتحة الإضاءة الفوقية. ركز الليزر الذي يبلغ قطره 488 نانومتر على بقعة صغيرة على سقف الغرفة وقم بزيادة زاوية الحدوث حتى تجاوز الزاوية الحرجة ، مع مراقبة التألق على الكاميرا في وضع مباشر. لاحظ انخفاضا حادا في التألق في الخلفية ومستوى تركيز بؤري واحد عند تجاوز الزاوية الحرجة.
حدد الخلايا للتصوير باستخدام الوضع المباشر للكاميرا باستخدام RICM. احصل على صور RICM و TIRF للأكتين عند إثارة 488 نانومتر ، وتوتر الإنتيغرين عند إثارة 561 نانومتر ، والباكسيلين عند إثارة 647 نانومتر. احصل على الصور بالتتابع باستخدام وقت تعريض ضوئي يبلغ 200 مللي ثانية.
تغيير زلات الغطاء والتركيز البؤري والتكرار. تم طلاء خلايا Cos-7 على سطح TGT هذا مع أو بدون تحفيز EGF لدراسة تأثير تنشيط EGFR مع تحفيز الليجند على ميكانيكا الإنتغرين. إذا ربط الإنتيغرين الرباط وطبق قوة أكبر من إجمالي عتبة التوتر للمسبار ، فسوف ينفصل الحمض النووي المزدوج ، مما يؤدي إلى التألق.
أي مسبار TGT لم تتمزق فيه قوة ميكانيكية سيبقى غير فلورسنت. تم احتضان الخلايا مع أو بدون EGF على أسطح TGT لمدة 60 دقيقة ، ثابتة ، وملطخة بالمناعة لعرض توزيع الالتصاق البؤري وتنظيم الهيكل الخلوي. في صورة RICM ، تم تعزيز خلية Cos-7 المنتشرة على سطح TGT 56-piconewton بشكل كبير مع تحفيز EGF مقارنة بدون تحفيز.
أدى التحفيز باستخدام EGF إلى مورفولوجيا أكثر دائرية ، تمثل خلايا Cos-7 تنتشر وتنمو. التألق من المجسات المفتوحة أعلى أيضا مع تحفيز EGF ، كما لوحظ في صورة التألق التوتر. كانت الكثافة المتكاملة للمجسات المفتوحة المتناسبة مع عدد المجسات المفتوحة أعلى بكثير مع تحفيز EGF من دون تحفيز.
تذكر دائما اتجاه انزلاقات الغطاء ، مع الحفاظ على السطح الوظيفي متجها لأعلى. عند فصل الساندويتش ، كن لطيفا حتى لا يخدش السطح أو يتلف. بعد التوليف السطحي ، يمكن للمرء أن يسبر بحثا عن البروتينات السيتوبلازمية التي تنظم التصاق الخلايا أو النقل الميكانيكي.
وهذا يسمح بتحديد جزيئات الإشارات النهائية المشاركة في تنسيق ميكانيكا الخلايا في غشاء البلازما.
