Este protocolo es significativo debido a la simplicidad de la plataforma de sensores TGT utilizada para estudiar la diafonía EGFR-integrina y su influencia en las fuerzas mecánicas celulares. Rao esbozó investigar la regulación dependiente de EGF de la mecánica celular. El protocolo es adaptable para diferentes ligandos, tipos de células, paradigmas de estimulación y se puede combinar con TGT de umbrales de tensión variables.
La síntesis superficial puede parecer intimidante al principio. La clave es estar preparado y organizado para ejecutar con precisión los intrincados pasos mediante el empleo de una lista de verificación para la preparación y los cálculos de reactivos. El primer día, coloque hasta ocho resbalones de cubierta de vidrio de 25 milímetros en un estante de politetrafluoroetileno.
Coloque el bastidor en un vaso de precipitados de borosilicato de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de etanol a prueba de 200. Sonicar a una frecuencia de funcionamiento de 35 kilohercios durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Llene un vaso de precipitados de 50 mililitros con 40 mililitros de solución de piraña recién preparada mezclando ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3: 1 en un vaso de precipitados Pyrex y revolviendo con una pipeta de vidrio.
Transfiera el bastidor deslizante de la cubierta al vaso de precipitados e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la campana extractora de humos para grabar la superficie de deslizamiento de la cubierta. Después del grabado, transfiera el bastidor deslizante de la cubierta a un vaso de precipitados con agua ultrapura con pinzas. Inspeccione visualmente los resbalones de la cubierta para asegurarse de que las superficies se vean limpias sin patrones ni partículas de polvo en la superficie del vidrio.
Transfiera el bastidor deslizante de la cubierta a un vaso de precipitados con etanol a prueba de 200 y lávelo dos veces durante 15 segundos para equilibrar las superficies con disolvente orgánico. Transfiera el bastidor deslizante de la cubierta a una solución de etanol a prueba de 200 con 3% APTES durante una hora a temperatura ambiente para silanizar los resbalones de la cubierta. Sumerja el bastidor en un vaso de precipitados limpio con una solución de etanol a prueba de 200.
Seque los resbalones de la cubierta utilizando gas nitrógeno con baja presión de salida. Coloque los deslizamientos de la cubierta en un plato de poliestireno de 10 centímetros con un trozo de película de parrafina colocado plano dentro de él. Agregue 100 microlitros de dos miligramos por mililitro de solución de biotina NHS en DMSO a cuatro hojas de cubierta colocadas en película de parafina.
Coloque un sándwich con los otros cuatro deslizamientos de cubierta en la parte superior, con dos deslizamientos de cubierta uno hacia el otro con la solución de funcionalización en el medio. En el segundo día, retire el plato de cuatro grados centígrados y separe los resbalones de la cubierta intercalada. Evite rascarse o dañar la superficie funcionalizada mientras separa el sándwich.
Luego, oriente los deslizamientos de la cubierta en el bastidor con la superficie recubierta una frente a la otra. Secar con gas nitrógeno. Coloque los resbalones de la cubierta en un plato nuevo con una película de parrafina en su interior.
Agregue 800 microlitros de albúmina sérica bovina al 0.1% en 1X PBS a cada hoja de cubierta. Incubar los resbalones de la cubierta a temperatura ambiente durante 30 minutos para pasivar la superficie y bloquear la unión inespecífica de los reactivos de funcionalización posteriores. Para funcionalizar los resbalones de la cubierta, agregue 800 microlitros de un microgramo por mililitro de estreptavidina en 1X PBS a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos.
Ensamble las sondas TGT en un tubo de PCR utilizando un termociclador. Después de la incubación, lave los resbalones de la cubierta tres veces con 1X PBS. Agregue 100 microlitros de las sondas TGT premontadas a cuatro deslizamientos de cubierta y haga sándwiches usando los cuatro resbalones de cubierta restantes con el lado funcionalizado frente a las sondas.
Cubrir con papel de aluminio. Después de la incubación, separe los sándwiches y lave los resbalones de la cubierta con 1X PBS tres veces. Ensamble cuidadosamente los deslizamientos de la cubierta en cámaras de imágenes previamente limpiadas.
Para investigar el efecto de la estimulación del factor de crecimiento epidérmico sobre la mecánica, la adhesión y la propagación celular de Cos-7, tripsinize las células Cos-7 con 0,05% de tripsina-EDTA durante dos minutos. Neutralice la tripsina lavando con HBSS y centrifugando a 800 G durante cinco minutos. Células de placa a una densidad de 40, 000 células en las superficies TGT ensambladas en DMEM suplementadas con 50 nanogramos por mililitro EGF o DMEM sin EGF.
Después de la incubación, lave las células tres veces con 1X PBS. Fijar con dos mililitros de paraformaldehído al 4% durante 12 minutos a temperatura ambiente. Lave los resbalones de la cubierta cinco veces con 1X PBS a intervalos de cinco minutos a temperatura ambiente.
Opcionalmente, incube los resbalones de la cubierta con cloruro de amonio 50 milimolar en 1X PBS durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Agregue el búfer A y coloque las cámaras de imágenes con resbalones de cubierta en un recipiente de humedad. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados para bloquear y permeabilizar las células.
Diluya el anticuerpo anti-paxillin primario a 1:250 diluciones en tampón de bloqueo. Incubar con 200 microlitros de solución primaria de anticuerpos por resbalón de cubierta durante dos horas a 37 grados centígrados. Etiquete las células simultáneamente con una mezcla de anticuerpo secundario di-conjugado cabra/anti-conejo en dilución 1:800 y faloidina di-conjugada a 1:400 diluciones en 200 microlitros de tampón de bloqueo por deslizamiento de cubierta.
Lave las superficies cinco veces con 1X PBS a intervalos de cinco minutos. Para comenzar, agregue aceite al objetivo, limpie el fondo de la tapa de la cámara de muestra y coloque la muestra en el escenario. Concéntrese en una célula y enganche el enfoque perfecto.
Alinee el RICM cerrando y centrando el diafragma de apertura de epi-iluminación. Enfoca el láser de 488 nanómetros a un pequeño punto en el techo de la habitación y aumenta el ángulo de incidencia hasta que pase el ángulo crítico, mientras monitoreas la fluorescencia en la cámara en modo en vivo. Observe una reducción brusca en la fluorescencia de fondo y un solo plano de enfoque cuando se supere el ángulo crítico.
Identifique las células para la obtención de imágenes utilizando el modo en vivo de la cámara utilizando RICM. Adquiera las imágenes RICM y TIRF de actina a excitación de 488 nanómetros, tensión de integrina a excitación de 561 nanómetros y paxillin a excitación de 647 nanómetros. Obtenga imágenes secuencialmente utilizando un tiempo de exposición de 200 milisegundos.
Cambie los resbalones de la cubierta, enfoque y repita. Las células Cos-7 se colocaron en esta superficie TGT con o sin estimulación EGF para estudiar el impacto de la activación de EGFR con estimulación de ligandos en la mecánica de integrinas. Si una integrina se une al ligando y aplica una fuerza mayor que el umbral de tensión total de la sonda, el dúplex de ADN se separará, lo que conducirá a la fluorescencia.
Cualquier sonda TGT que una fuerza mecánica no se haya roto permanecerá no fluorescente. Las células se incubaron con o sin EGF en las superficies de TGT durante 60 minutos, se fijaron e inmunoteñiron para mostrar la distribución de adhesión focal y la organización del citoesqueleto. En la imagen RICM, la propagación de la célula Cos-7 en la superficie TGT de 56 piconewton se mejoró significativamente con la estimulación de EGF en comparación con la estimulación sin estimulación.
La estimulación con EGF dio como resultado una morfología más circular, que representa la propagación y el crecimiento de las células cos-7. La fluorescencia de las sondas abiertas también es mayor con la estimulación de EGF, como se observa en la imagen de fluorescencia de tensión. La intensidad integrada de las sondas abiertas proporcional al número de sondas abiertas fue mucho mayor con la estimulación EGF que sin estimulación.
Recuerde siempre la orientación de los resbalones de la cubierta, manteniendo la superficie funcionalizada mirando hacia arriba. Al separar el sándwich, sea suave para que la superficie no se raye o dañe. Después de la síntesis superficial, se puede sondear proteínas citoplasmáticas que regulan la adhesión celular o la transducción mecánica.
Esto permite la identificación de moléculas de señalización aguas abajo involucradas en la orquestación de la mecánica celular en la membrana plasmática.
