Este protocolo permite evaluar la ubiquitilación de un sustrato específico por una ligasa E3. Sabemos que la caracterización de la interacción ligasa-sustrato es crucial para comprender su función en las células. Esta técnica no requiere reactivos costosos o equipos sofisticados.
Necesita plásmidos y codificar los genes de interés, desarrollando un ensayo de inmunoprecipitación con lisados celulares, y un Western blot para detectar la ubiquitilación del sustrato. Varias enfermedades humanas como el cáncer y los trastornos neurológicos están asociadas con la desregulación de la ligasa E3. Por lo tanto, la identificación de la ubiquitilación del sustrato por ligasa E3 específica podría ayudar a tratar o diagnosticar esas enfermedades.
La demostración del procedimiento será realizada por Valentine Spagnol. Para comenzar, cultive la línea celular HEK293T a 80 a 90% de confluencia en el medio Eagles modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 unidades de penicilina, 100 microgramos de estreptomicina y 0.292 miligramos por mililitros de L-glutamina. Luego, incuba este cultivo a 37 grados Centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificado al 5% de dióxido de carbono.
Pase las células aspirando los medios de la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica y lávelas una vez con un mililitro de PBS 1X esterilizado. A continuación, separe las células agregando un mililitro de solución de ácido tripsina etilendiaminotetraacético y después de cinco minutos de incubación a 37 grados centígrados, resuspenda estas células en dos mililitros de medios de crecimiento utilizando una pipeta serológica. Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco y limpio de 15 mililitros y centrífuga a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego, retire suavemente el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en tres mililitros de medios de crecimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión celular homogénea. Luego, transfiera un mililitro de esta suspensión celular a una placa de cultivo tratada con TC de 100 milímetros que contenga nueve mililitros de medios de crecimiento. Antes de la transfección, certifique si las células están libres de contaminación y en una confluencia adecuada para las transfecciones transitorias.
Para cada muestra de transfección, prepare los complejos ADN-polietilenimina diluyendo tres microgramos de cada plásmido en 100 microlitros de medio sérico reducido Opti-MEM 1 sin suplementación y mezclándolo suavemente canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo. A continuación, descongele el ADN-polietileneimino a temperatura ambiente y agréguelo a la solución siguiendo una proporción de tres microlitros de ADN-polietileneimina por un microgramo de ADN. Homogeneizar la solución mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
Luego, incubarlo durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de ADN-polietileneimina. Agregue el volumen total de complejos de ADN-polietileneimina a cada plato que contenga el cultivo celular y mézclelo suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Luego, incuba estas células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificado.
Después de la incubación y seis horas antes de la lisis celular, tratar las células transfectadas con el inhibidor del proteasoma 10 micromolar MG132 e incubar las células en la incubadora de cultivo celular humidificado. A continuación, aspire los medios de cada plato de cultivo con una pipeta serológica y lave las células una vez con un mililitro de 1X PBS. Luego, separe las células agregando un mililitro de tripsina e incube el plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Resuspender las células en un mililitro de medios de crecimiento y transferir la suspensión celular a un microtubo fresco y limpio de dos mililitros y centrifugarla a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez que termine la centrifugación, retire el sobrenadante vertiéndolo con cuidado y resuspenda suavemente el gránulo celular en 200 microlitros de tampón de lisis MP40 helado complementado con el cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Luego transfiera esta solución a un microtubo limpio de 1.5 mililitros.
Incubar esta célula lisar durante 30 minutos en hielo, y después de la incubación, centrifugar la célula lisa a 16, 900 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, equilibre las perlas anti-HA de agarosa con un tampón de lisis MP40 helado. Utilice 15 microlitros de perlas anti-HA de agarosa para cada muestra.
Lave las perlas con 200 microlitros de tampón de lisis MP40 pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. A continuación, aspire y deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y repita este proceso tres veces. Después, mantenga las cuentas equilibradas en hielo hasta su uso.
Después de centrifugar los lisados celulares, recuperar el sobrenadante y cuantificar el contenido de proteína en el lisado total utilizando el método bradford para asegurar que cada muestra sometida a inmunoprecipitación presenta una cantidad igual de proteína. Incubar el volumen necesario de lisado celular con las perlas anti-HA de agarosa equilibradas durante cuatro horas, girando suavemente en una incubadora giratoria a cuatro grados centígrados, lo que permite que el UXT-V2-HA se una a las perlas anti-HA de agarosa. Recoja las perlas anti-HA de agarosa pulsándolas en un tubo de microcentrífuga a 3.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Aspira con cuidado y desecha el sobrenadante. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis de celda MP40 helado y dos veces con tampón FLAG HA helado. Después del lavado final, retire todo el sobrenadante con cuidado con una pipeta y eluya la proteína poliubiquitilada con 300 microgramos por mililitro de péptido HA diluido en tampón FLAG HA.
Incubar las perlas anti-HA de agarosa con péptido HA durante una hora a cuatro grados centígrados en una plataforma agitadora oscilante. A continuación, gire las perlas a 3, 000 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene las proteínas poli-ubiquitinadas. Si es necesario, guarde el eluyente en un microtubo fresco y limpio a menos 20 grados centígrados.
Resuelva los eluyentes y los lisados celulares en electroforesis e inmunoblotting en gel de dodecil sulfato de sodio al 10%. Para realizar un Western blotting de transferencia húmeda, coloque el gel en un sándwich de transferencia compuesto de papel de filtro, papel de filtro de membrana de gel, acolcharlo con almohadillas y presionarlo junto con una rejilla de soporte. Luego, coloque este sistema verticalmente en un tanque lleno de tampón de transferencia entre los electrodos de alambre de acero inoxidable o platino.
La transferencia ocurre durante 90 minutos a 150 voltios en un búfer de transferencia húmedo. Finalmente, sondee la membrana de immunoblot usando anticuerpos anti-myc. La poli-ubiquitilación específica de UXT-V2-HA mediada por la proteína F-box 7 en las células se observó después de sondear el eluyente de la inmunoprecipitación anti-HA con un anticuerpo anti-myc, que detecta el myc-ub conjugado al sustrato.
La especificidad de anti-myc para sustrato poli-ubiquitilado se visualizó en los carriles uno y dos, en los que no se detectó un frotis de proteínas poli-ubiquitiladas cuando las células fueron co-transfectadas con la proteína F-box 7 y myc-ub en ausencia de plásmido UXT-V2-HA. Además, no se visualizó ningún frotis correspondiente a la poli-ubiquitinación proteica en la combinación de la proteína F-box 7 y UXT-V2-HA sin el plásmido myc-ub. Cuando un mutante de la proteína F-box 7 o de la proteína F-box 7 de tipo F de vector vacío incapaz de ensamblar SCF activo fue transectado en combinación con UXT-V2-HA y myc-ub, se observó una fuerte señal de frotis de UXT-V2 poli-ubiquitilado solo para la proteína F-box 7 de tipo salvaje, lo que sugiere que UXT-V2 fue poli-ubiquitilado por el complejo y las células de la proteína F-box de SCF en comparación con los controles.
Las etapas de monoprecipitación, incluida la incubación de lisados celulares con las perlas equilibradas y la elución de proteínas inmunoprecipitadas, son esenciales para lograr el objetivo de este protocolo. Después de este procedimiento, se debe realizar un ensayo de ubiquitilación in vitro para confirmar la especificidad de la ubiquitilación del sustrato por la ligasa E3.
