Este protocolo permite avaliar a ubiquização de um substrato específico por uma ligase E3. Sabemos que a caracterização da interação ligase-substrato é crucial para entender sua função nas células. Esta técnica não requer reagentes caros ou equipamentos sofisticados.
Precisa de plasmídeos e codificação dos genes de interesse, desenvolvendo um ensaio de imunoprecipitação com lises celulares, e uma mancha ocidental para detectar ubiquização substrato. Várias doenças humanas, como câncer e distúrbios neurológicos, estão associadas à desregulação da ligase E3. Assim, a identificação da ubiquidade substrato por ligase específica do E3 poderia auxiliar no tratamento ou diagnóstico dessas doenças.
Demonstrar o procedimento será de Valentine Spagnol. Para começar, cresça a linha de células HEK293T para 80 a 90% de confluência no meio modificado de Águias de Dulbecco complementado com soro bovino 10% fetal e 100 unidades de penicilina, 100 microgramas estreptomicina e 0,292 miligramas por mililitros L-glutamina. Então, incubar essa cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular umidificada a 5% de dióxido de carbono.
Passagem as células aspirando a mídia do prato de cultura usando uma pipeta sorológica e lave-as uma vez com um mililitro de 1X PBS esterilizado. Em seguida, desprende as células adicionando um mililitro de solução de ácido etilenodiaminetetraactic e após cinco minutos de incubação a 37 graus Celsius, resuspenda essas células em dois mililitros de mídia de crescimento usando uma pipeta sorológica. Transfira a suspensão celular para um tubo fresco e limpo de 15 mililitros e centrífuga a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, remova suavemente o supernasce e resuspenque a pelota de célula em três mililitros de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo para obter uma suspensão celular homogênea. Em seguida, transfira um mililitro desta suspensão celular para um prato de cultura tratado com TC de 100 milímetros contendo nove mililitros de mídia de crescimento. Antes da transfecção, certifique-se se as células estão livres de contaminação e em uma confluência adequada para transfecções transitórias.
Para cada amostra de transfecção, prepare os complexos de DNA-polietileneimina diluindo três microgramas de cada plasmídeo em 100 microliters de opti-MEM 1 meio soro reduzido sem suplementação e misturando-o suavemente, pipetando a solução para cima e para baixo. Em seguida, descongele o DNA-polietileneimina à temperatura ambiente e adicione-o à solução seguindo uma proporção de três microlitadores de DNA-polietileneimina por um micrograma de DNA. Homogeneize a solução se escoando para cima e para baixo.
Em seguida, incuba-o por 15 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de DNA-polietileneimina. Adicione o volume total de complexos de DNA-polietileneimina a cada prato contendo a cultura celular e misture-o suavemente balançando a placa para frente e para trás. Em seguida, incubar essas células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular umidificada.
Após a incubação e seis horas antes da lise celular, trate as células transfeinadas com 10 micromolars proteasome inibidor MG132 e incubar as células na incubadora de cultura celular umidificada. Em seguida, aspire a mídia de cada prato de cultura usando uma pipeta sorológica e lave as células uma vez com um mililitro de 1X PBS. Em seguida, desprende as células adicionando um mililitro trypsin e incubar o prato a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Resuspenja as células em um mililitro de mídia de crescimento e transfira a suspensão celular para um microtubo fresco e limpo de dois mililitros e centrifuá-lo a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Uma vez que a centrifugação acabou, remova o supernacido, despejando-o cuidadosamente e suavemente resuspend a pelota celular em 200 microliters de tampão de lise MP40 gelado complementado com o coquetel de inibidores de protease e fosfatase. Em seguida, transfira esta solução para um microtubo limpo de 1,5 mililitro.
Incubar esta célula por 30 minutos no gelo, e após a incubação, centrifugar as células lísatos a 16.900 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, equilibre as contas anti-HA agarose com tampão de lise MP40 gelado. Use 15 microliters de contas anti-HA agarose para cada amostra.
Lave as contas com 200 microliters de tampão de lise MP40 pulsando-as em um tubo de microcrédito a 3.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire e descarte o supernatante cuidadosamente com uma pipeta e repita esse processo três vezes. Depois, mantenha as contas equilibradas no gelo até o uso.
Após centrifugar os lises celulares, recupere o supernasal e quantifique o teor de proteína no total do lysate usando o método Bradford para garantir que cada amostra submetida à imunoprecipitação apresente uma quantidade igual de proteína. Incubar o volume necessário de lise celular com as contas anti-HA equilibradas por quatro horas, girando suavemente em uma incubadora rotativa a quatro graus Celsius, o que permite que o UXT-V2-HA se ligue às contas anti-HA agarose. Colete as contas anti-HA agarose, pulsando-as em um tubo de microcentrifuuge a 3.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius.
Aspire cuidadosamente e descarte o supernatante. Lave as contas três vezes com tampão de lise celular MP40 gelado e duas vezes com tampão HA FLAG HA gelado. Após a lavagem final, remova todo o supernatante cuidadosamente usando uma pipeta e elute a proteína poli-ubiquitylated com 300 microgramas por mililitro de peptídeo HA diluído no buffer FLAG HA.
Incubar as contas anti-HA agarose com peptídeo HA por uma hora a quatro graus Celsius em uma plataforma de shaker de balanço. Em seguida, gire as contas a 3.000 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenante contendo as proteínas poli-ubiquitinadas. Se necessário, armazene o eluent em um microtubo fresco e limpo a menos 20 graus Celsius.
Resolva os eluents e os lises celulares em 10% de sulfato de sódio de poliacrilamida eletroforese e imunoblotação. Para realizar uma transferência molhada, coloque o gel em um sanduíche de transferência composto de papel filtro, papel filtro de membrana gel, amorteça-o com almofadas e pressione-o junto por uma grade de suporte. Em seguida, coloque este sistema verticalmente em um tanque cheio de buffer de transferência entre eletrodos de aço inoxidável ou fio de platina.
A transferência ocorre por 90 minutos a 150 volts em um buffer de transferência molhado. Finalmente, teste a membrana do imunobloto usando anticorpo anti-mirílico. A poli-ubiquização específica de UXT-V2-HA mediada pela proteína F-box 7 nas células foi observada após sondar o eluente da imunoprecipitação anti-HA com um anticorpo anti-micóc, que detecta o micrúnico conjugado ao substrato.
A especificidade do anti-mimato para substrato poli-ubiquílico foi visualizada nas faixas um e dois, onde uma mancha de proteínas poli-ubinciadas não foi detectada quando as células foram co-transtraídas com proteína F-box 7 e myc-ub na ausência de plasmídeo UXT-V2-HA. Além disso, nenhuma mancha correspondente à poli-ubiquização proteica foi visualizada na combinação de proteína F-box 7 e UXT-V2-HA sem o plasmídeo myc-ub. Quando uma proteína de caixa F de vetor vazio 7 ou proteína F-box 7 mutante incapaz de montar SCF ativo foi transectada em combinação com UXT-V2-HA e myc-ub, um forte sinal de difamação de UXT-V2 poli-ubiquílico foi observado apenas para a proteína da caixa F 7, sugerindo que o UXT-V2 foi poli-ubiquílico pelo complexo de proteína scf f-box 7 e células em comparação com os controles.
Os passos de mono-precipitação, incluindo a incubação de lisatos celulares com as contas equilibradas e a eluição de proteínas imunoprecipitadas são essenciais para alcançar o objetivo deste protocolo. Após este procedimento, deve-se realizar um ensaio de onipresença in vitro para confirmar a especificidade da ubiquidade do substrato pela ligase E3.
