Dieses Protokoll ermöglicht es, die Ubiquitylierung eines bestimmten Substrats durch eine E3-Ligase zu bewerten. Wir wissen, dass die Charakterisierung der Ligase-Substrat-Interaktion entscheidend ist, um ihre Funktion in Zellen zu verstehen. Diese Technik erfordert keine teuren Reagenzien oder ausgeklügelte Ausrüstung.
Es benötigt Plasmide und die Kodierung der interessierenden Gene, entwickelt einen Immunpräzipitationsassay mit Zelllysaten und einen Western Blot zum Nachweis der Substratubiquitylierung. Mehrere menschliche Krankheiten wie Krebs und neurologische Störungen sind mit einer Dysregulation der E3-Ligase verbunden. Daher könnte die Identifizierung der Substratubiquitylierung durch spezifische E3-Ligase bei der Behandlung oder Diagnose dieser Krankheiten helfen.
Die Demonstration des Verfahrens wird von Valentine Spagnol sein. Erhöhen Sie zunächst die HEK293T-Zelllinie auf 80 bis 90% Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten Penicillin, 100 Mikrogramm Streptomycin und 0,292 Milligramm pro Milliliter L-Glutamin. Dann inkubieren Sie diese Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5% Kohlendioxid.
Passieren Sie die Zellen, indem Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus der Kulturschale absaugen und waschen Sie sie einmal mit einem Milliliter sterilisiertem 1X PBS. Als nächstes lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäurelösung und suspendieren diese Zellen nach fünf Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius in zwei Millilitern Wachstumsmedien mit einer serologischen Pipette. Die Zellsuspension in ein frisches und sauberes 15-Milliliter-Röhrchen geben und bei 500 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern Wachstumsmedien durch Pipettieren nach oben und unten, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dann einen Milliliter dieser Zellsuspension auf eine 100-Millimeter-TC-behandelte Kulturschale, die neun Milliliter Wachstumsmedien enthält. Bestätigen Sie vor der Transfektion, ob die Zellen frei von Kontamination sind und sich an einem angemessenen Zusammenfluss für vorübergehende Transfektionen befinden.
Für jede Transfektionsprobe bereiten Sie die DNA-Polyethyleneim-Komplexe vor, indem Sie drei Mikrogramm jedes Plasmids in 100 Mikroliter Opti-MEM 1 reduziertem Serummedium ohne Supplementierung verdünnen und vorsichtig mischen, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Als nächstes tauen Sie das DNA-Polyethyleneimin bei Raumtemperatur auf und fügen Sie es der Lösung hinzu, nachdem Sie einen Anteil von drei Mikrolitern DNA-Polyethyleneimin pro Mikrogramm DNA erreicht haben. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie sie nach oben und unten pipettieren.
Dann inkubieren Sie es für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung von DNA-Polyethyleneimin-Komplexen zu ermöglichen. Fügen Sie das Gesamtvolumen der DNA-Polyethyleneim-Komplexe zu jeder Schale hinzu, die die Zellkultur enthält, und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Platte hin und her schaukeln. Dann inkubieren Sie diese Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator.
Nach der Inkubation und sechs Stunden vor der Zelllyse die transfizierten Zellen mit dem 10-Mikromolaren Proteasom-Inhibitor MG132 behandeln und die Zellen im befeuchteten Zellkultur-Inkubator inkubieren. Als nächstes aspirieren Sie die Medien aus jeder Kulturschale mit einer serologischen Pipette und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter 1X PBS. Dann lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter Trypsin und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Wachstumsmedien und übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches und sauberes Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 500 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sobald die Zentrifugation beendet ist, entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig ausgießen und das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern eiskaltem MP40-Lysepuffer resuspendieren, ergänzt durch den Protease- und Phosphatase-Inhibitoren-Cocktail. Dann geben Sie diese Lösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.
Inkubieren Sie dieses Zelllysat für 30 Minuten auf Eis und zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zelllysate bei 16.900 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. In der Zwischenzeit die Agarose-Anti-HA-Perlen mit eiskaltem MP40-Lysepuffer ausgleichen. Verwenden Sie 15 Mikroliter Agarose-Anti-HA-Perlen für jede Probe.
Waschen Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern MP40-Lysepuffer, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius pulsieren. Als nächstes aspirieren und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Danach halten Sie die Perlen bis zum Gebrauch auf Eis ausgeglichen.
Nach dem Zentrifugieren der Zelllysate wird der Überstand zurückgewonnen und der Proteingehalt im Gesamtlysat mit der Bradford-Methode quantifiziert, um sicherzustellen, dass jede Probe, die einer Immunpräzipitation unterzogen wird, eine gleiche Menge an Protein aufweist. Inkubieren Sie das notwendige Zelllysatvolumen mit den ausgleichenden Agarose-Anti-HA-Perlen vier Stunden lang und drehen Sie sich vorsichtig in einem rotierenden Inkubator bei vier Grad Celsius, wodurch sich der UXT-V2-HA an die Agarose-Anti-HA-Perlen binden kann. Sammeln Sie die Agarose-Anti-HA-Perlen, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius pulsieren.
Den Überstand vorsichtig absaugen und verwerfen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit eiskaltem MP40-Zelllysepuffer und zweimal mit eiskaltem FLAG HA-Puffer. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den gesamten Überstand vorsichtig mit einer Pipette und eluieren Sie das polyubiquitylierte Protein mit 300 Mikrogramm pro Milliliter HA-Peptid, verdünnt auf FLAG HA-Puffer.
Inkubieren Sie die Agarose-Anti-HA-Perlen mit HA-Peptid für eine Stunde bei vier Grad Celsius in einer schaukelnden Shaker-Plattform. Als nächstes drehen Sie die Perlen bei 3.000 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius nach unten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, der die polyubiquitinierten Proteine enthält. Bei Bedarf lagern Sie das Elutionsmittel in einem frischen und sauberen Mikroröhrchen bei minus 20 Grad Celsius.
Lösen Sie die Eluenten und die Zelllysate in 10% Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting auf. Um ein Wet Transfer Western Blotting durchzuführen, legen Sie das Gel in ein Transfersandwich aus Filterpapier, Gelmembranfilterpapier, polstern Sie es mit Pads und drücken Sie es durch ein Stützgitter zusammen. Platzieren Sie dieses System dann vertikal in einem Tank, der mit Transferpuffer zwischen Edelstahl- oder Platindrahtelektroden gefüllt ist.
Die Übertragung erfolgt für 90 Minuten bei 150 Volt in einem nassen Transferpuffer. Sondieren Sie schließlich die Immunoblot-Membran mit einem Anti-Myc-Antikörper. Die spezifische Polyubiquitylierung von UXT-V2-HA, vermittelt durch F-Box-Protein 7 in Zellen, wurde beobachtet, nachdem das Elutionsmittel aus Anti-HA-Immunpräzipitation mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht wurde, der das mit dem Substrat konjugierte Myc-UB nachweist.
Die Spezifität von Anti-Myc für polyubiquityliertes Substrat wurde in den Bahnen eins und zwei visualisiert, wobei ein Abstrich von polyubiquitylierten Proteinen nicht nachgewiesen wurde, wenn Zellen in Abwesenheit von UXT-V2-HA-Plasmid mit F-Box-Protein 7 und Myc-ub co-transfiziert wurden. Zusätzlich wurde in der Kombination von F-box Protein 7 und UXT-V2-HA ohne das Myc-ub-Plasmid kein Abstrich visualisiert, der der Protein-Polyubiquitinierung entspricht. Wenn eine leere Vektor-Wildtyp-F-Box-Protein-7- oder F-Box-Protein-7-Mutante, die nicht in der Lage war, aktives SCF zusammenzusetzen, in Kombination mit UXT-V2-HA und Myc-ub transeziert wurde, wurde ein starkes Abstrichsignal von polyubiquityliertem UXT-V2 nur für Wildtyp-F-Box-Protein 7 beobachtet, was darauf hindeutet, dass UXT-V2 durch SCF F-Box-Protein-7-Komplex und Zellen im Vergleich zu den Kontrollen polyubiquityliert wurde.
Die Mono-Fällungsschritte, einschließlich der Inkubation von Zelllysaten mit den Gleichgewichtsperlen und der Elution von immunpräzipitierten Proteinen, sind unerlässlich, um das Ziel dieses Protokolls zu erreichen. Nach diesem Verfahren sollte ein In-vitro-Ubiquitylierungsassay durchgeführt werden, um die Spezifität der Substratubiquitylierung durch die E3-Ligase zu bestätigen.
