膜融合介导许多生物学功能。该协议描述了一种检测融合孔隙开度和发射机释放动力学并区分三种融合模式的方法:紧密融合，停留融合和收缩融合。共聚焦显微镜和膜片钳记录的结合有助于融合孔隙开放和闭合的可视化以及动力学的测定。
虽然描述了嗜铬细胞，但这里描述的方法的原理可以广泛应用于许多分泌细胞，远远超出嗜铬细胞。该方法的成功实施取决于几个一般步骤，例如产生健康的原代嗜铬细胞培养物，足够的质粒转染效率和高电生理记录成功率。选择三个完整的腺体，表面没有割伤或出血，并用剪刀去除脂肪组织。
用洛克的溶液灌注来清洗腺体，直到没有血液流出。为了消化，使用30毫米注射器通过肾上腺静脉注射酶溶液，注射器与0.22微米过滤器连接，直到腺体开始膨胀。然后将腺体在37摄氏度下放置10分钟。
再次注射，将腺体保持在37摄氏度下10分钟。消化后，用剪刀纵向切开从肾上腺静脉到另一端的腺体以展开腺体。通过将白色延髓分成几块放入含有洛克溶液的10厘米培养皿中来隔离白色延髓。
用剪刀切碎延髓。用80至100微米尼龙网过滤延髓悬浮液到烧杯中。将滤液转移到50毫升锥形管中，并在48×g室温下离心三分钟，减速3分钟。
离心后，除去上清液，并通过移液将细胞沉淀与Locke溶液重悬。用80至100微米过滤器过滤细胞悬浮液，并在48×g室温下离心三分钟，减速三分钟。除去上清液并用30毫升培养基重悬细胞沉淀。
使用血细胞计数器计数室确定细胞数。将2， 800， 000个细胞转移到15毫升管中。通过以48×g离心两分钟，以三个减速沉淀细胞。
向细胞沉淀中加入制造商提供的100微升横断缓冲液。然后加入两微克PH-mNG质粒。通过将溶液上下管道轻轻混合悬浮液，并将混合物立即转移到电穿孔比色皿中。
立即将比色皿转移到电敏器，在屏幕列表中选择005程序，然后按Enter键进行电穿孔。电穿孔后，立即向比色皿中加入1.8毫升培养基，并与配备无菌尖端的微量移液管轻轻混合。在每个培养皿中将300微升电穿孔电池的悬浮液加入盖玻片上，总共镀五至六个培养皿，以进行一次电穿孔反应。
小心地将培养皿转移到37摄氏度的加湿培养箱中，用9%二氧化碳加热30分钟，并在30分钟后轻轻地向每个培养皿中加入两毫升预热培养基。从硼硅酸盐玻璃毛细管制备贴片移液器，方法是用移液器拉动它们，用液体蜡涂覆它们的尖端，并用微锻造抛光它们。打开膜片钳记录放大器并启动软件。
设置软件适当的钙电流和电容记录参数。设置总共60秒持续时间的记录协议，其中刺激从10秒开始。将电压钳位记录的保持电位设置为 80 毫伏。
设置一秒钟的去极化，从零下80毫伏到10毫伏，作为刺激诱导钙流入和电容跳跃。打开共聚焦显微镜系统并在软件中设置适当的参数。打开激光器，包括458纳米，514纳米和633纳米，并根据每个荧光探针设置每个激光器的发射收集范围。
选择细胞状态良好且表达适当的培养皿，并在培养皿中的培养基中加入两微升荧光假神经递质FFN511。将培养皿放回培养箱中20分钟。加载FFN511后，制备记录室，并将两微升荧光染料A655加入50微升浴液中。
用镊子将盖玻片从培养皿转移到记录室中，并立即加入含有浴液的A655。在100X油浸物镜上滴一滴油。将腔室安装在显微镜中，并使用调节旋钮使油刚好接触到盖子的底部滑动。
将细胞聚焦，并使用明场和共聚焦成像找到具有mNG表达的合适细胞。放大所选单元格并将其居中显示在视野中，从而最大限度地减少空白区域。在 FFN511、PH-mNG 和 A665 的固定 Z 平面上设置 XY 平面共聚焦成像的参数，并最小化时间间隔。
使用微调旋钮将焦点调整到单元格的底部。在软件中调整激发激光功率，找到一个设置，以获得最佳的信噪比，并避免明显的荧光漂白。将9微升内部溶液加入贴片移液器中，并将移液器连接到膜片钳放大器级的支架上。
用注射器施加少量正压，并移动移液器尖端以用显微操纵器触摸浴液溶液。通过电压脉冲测试，确保放大器显示移液器电阻大约在两到四兆欧之间。按 LJ/自动取消液体液络部。
用显微操作器将移液器向所选细胞移动。要形成细胞附着模式，请移动移液器吸头以触摸细胞。将保持电位从零更改为零80毫伏，同时使用注射器施加轻柔的负压。
一旦阻力超过 10 亿兆欧，请等待大约 30 秒，以使配置稳定下来。按 C-快速/自动以补偿快速电容。要形成批发模式，请用注射器施加短而强大的负压脉冲，直到膜破裂。
按 C 慢/自动以补偿慢速电容。稍微调整成像焦点以聚焦在细胞底部。通过单击两个不同的软件应用程序的"开始"按钮，同时启动共聚焦延时成像和膜片钳记录。
记录后，确保数据已保存。将保持电位改回零毫伏。将移液器移出浴液并丢弃。
使用任何制造商或提供的软件打开原始映像文件。转到"处理"，单击"处理工具"，然后使用工具为每个延时图像生成滚动平均文件。保存这些文件。
在量化下，转到"工具"，然后单击"堆栈配置文件"按钮，以检查刺激前后的时间点，并识别每个通道中的荧光变化。单击绘制椭圆按钮以圈出融合事件的感兴趣区域。右键单击图像，然后单击保存要保存的 ROI。
单击"打开项目"以找到原始文件。右键单击图像，然后单击加载ROI以加载原始成像文件中的ROI文件以测量荧光强度。转到"工具"，然后单击软件中的"排序投资回报率"，然后绘制每个ROI的所有三个通道的跟踪。
单击"报告"将 ROI 数据（包括数字数据和每个 ROI 的成像跟踪）保存到一个文件夹中。进行整个细胞膜片钳记录和应用从80到10毫伏的一秒钟去极化，以唤起外源和内吞作用。施加的去极化诱导向内钙电流，电容跳跃，表明胞吐，以及跳跃后电容衰减，表明内吞作用。
随着细胞底部的延时成像，由1秒去极化方案诱导的融合事件被指示为FFN减少，反映了FFN511的释放，伴随着FPH和A655斑点荧光的增加，反映了PH-mNG和A655从质膜和浴溶液扩散到熔融囊泡中。该图显示了被识别为F655调光的紧密聚变，而FPH持续或衰减延迟。该图表示通过存在PH-mNG和A655斑点检测到的停留融合。
该图表示检测到的平行FPH和F655衰变的收缩融合，伴随着PH-mNG斑点和A655斑点的平行尺寸减小 成功记录需要通过膜片钳和成像在每个通道的细胞底部生成具有适当荧光强度的整个细胞配置。这里描述的电生理学和超分辨率显微镜的结合是测量融合孔隙动力学和神经回路的宝贵工具。
