膜融合は多くの生物学的機能を媒介する。このプロトコルは、核融合孔の開口ダイナミクスと送信機の放出ダイナミクスを検出し、3つの融合モード(クローズフュージョン、ステイフュージョン、シュリンクフュージョン)を区別する方法を説明しています。共焦点顕微鏡とパッチクランプ記録の組み合わせにより、融合孔の開閉の可視化と、その動力学の決定が容易になります。
クロマフィン細胞について説明したが、ここで説明する方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。この方法の正常な実施は、健康な初代クロマフィン細胞培養物の生成、十分なプラスミドトランスフェクション効率、および高い電気生理学的記録成功率など、いくつかの一般的なステップに依存する。表面に切り傷や出血のない3つの無傷の腺を選択し、はさみで脂肪組織を除去します。
血液が出なくなるまでロックの溶液で灌流して腺を洗う。消化のために、腺が腫れ始めるまで、0.22マイクロメートルのフィルターを取り付けた30ミリメートルのシリンジを使用して、副腎静脈を通して酵素溶液を注入する。その後、腺を摂氏37度に10分間放置します。
もう一度注射し、腺を摂氏37度でさらに10分間放置する。消化後、副腎静脈から反対側の端まで腺を縦方向に切断し、腺を広げる。白い髄質を、ロックの溶液を含む10センチメートルのペトリ皿に細かくつまんで分離します。
はさみで髄質を切ってミンチにします。80〜100マイクロメートルのナイロンメッシュで髄質懸濁液をビーカーにろ過します。濾液を50ミリリットルの円錐管に移し、48 x gの室温で3分間、3回の減速で遠心分離する。
遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットをロック溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を80〜100マイクロメートルのストレーナーで濾過し、48 x gの室温で3分間減速3分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを30ミリリットルの培養液で再懸濁した。
血球計数計数器計数チャンバーを用いて細胞数を決定する。2, 800, 000セルを15ミリリットルのチューブに移す。3回の減速で2分間、48 x gで遠心分離することによって細胞をペレット化する。
製造業者から提供された100マイクロリットルの切除バッファーを細胞ペレットに加える。次いで、2マイクログラムのPH-mNGプラスミドを加える。溶液を上下に配管して懸濁液を穏やかに混合し、混合物を遅滞なくエレクトロポレーションキュベットに移す。
すぐにキュベットをエレクトロポレーターに移し、画面リストで005プログラムを選択し、Enterキーを押してエレクトロポレーションを実行します。エレクトロポレーション後、直ちに1.8ミリリットルの培地をキュベットに加え、滅菌チップを備えたマイクロピペットで穏やかに混合する。エレクトロポレーションされたセルの懸濁液300マイクロリットルを各ディッシュのカバースリップ上に加え、合計5〜6個のディッシュを1回のエレクトロポレーション反応のためにメッキする。
皿を摂氏37度の加湿インキュベーターに9%の二酸化炭素で30分間慎重に移し、30分後に2ミリリットルの予温培地を各皿に静かに加える。ホウケイ酸ガラス毛細血管からパッチピペットをピペットプーラーで引っ張り、先端を液体ワックスでコーティングし、マイクロフォージで研磨して準備します。パッチクランプ記録アンプの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。
ソフトウェアの適切なカルシウム電流と静電容量の記録パラメータを設定します。刺激が10秒から始まる合計で60秒の持続時間の記録プロトコルを設定します。電圧クランプ記録の保持電位を80ミリボルトに設定します。
カルシウム流入と静電容量ジャンプを誘導する刺激として、マイナス80ミリボルトから10ミリボルトまでの1秒間の分極解除を設定します。共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、ソフトウェアで適切なパラメータを設定します。458ナノメートル、514ナノメートル、633ナノメートルなどのレーザーをオンにし、各蛍光プローブに応じて各レーザーの発光収集範囲を設定します。
良好な細胞状態および適切な発現を有するディッシュを選択し、2マイクロリットルの蛍光偽神経伝達物質FFN511をディッシュ内の培地に加える。皿をインキュベーターに20分間戻します。FFN511を装填した後、記録チャンバーを準備し、50マイクロリットルの浴液に2マイクロリットルの蛍光色素A655を加える。
カバースリップを皿からピンセットで記録室に移し、すぐにA655入り浴液を加えます。100Xオイル浸漬対物レンズにオイルを1滴置きます。チャンバーを顕微鏡に取り付け、調整ノブを使用してオイルがカバースリップの底にちょうど接触するようにします。
細胞に焦点を合わせ、明視野および共焦点イメージングを使用して、mNG発現を有する適切な細胞を見つける。選択したセルを拡大し、視野の中央に配置して、空白領域を最小限に抑えます。FFN511、PH-mNG、およびA665の固定Z平面でXY平面共焦点イメージングのパラメータを最小の時間間隔で設定します。
微調整ノブでセルの下部にフォーカスを調整します。ソフトウェアで励起レーザー出力を調整して、最適な信号対雑音比を取得し、著しい蛍光漂白を回避するための設定を見つけます。9マイクロリットルの内部溶液をパッチピペットに加え、ピペットをパッチクランプアンプステージのホルダーに取り付けます。
シリンジで少量の陽圧をかけ、ピペットチップを動かしてマイクロマニピュレーターで浴液に触れます。電圧パルステストで、ピペット抵抗が約2~4メガオームであることをアンプが示していることを確認します。LJ/Autoを押して液体接合部をキャンセルします。
マイクロマニピュレーターでピペットを選択したセルに向かって移動させます。セル装着モードを形成するには、ピペットチップを動かしてセルに触れます。シリンジで穏やかな負圧をかけながら、保持電位をゼロからマイナス80ミリボルトに変更します。
抵抗が1ギガオームを超えたら、構成が安定するまで約30秒間待ちます。C-fast/Autoを押して、高速容量を補償します。卸売モードを形成するには、膜が破裂するまでシリンジで負圧の短いながらも強力なパルスを適用します。
C-slow/Autoを押して、遅い容量を補償します。イメージングの焦点を少し調整して、セルの底に焦点を合わせます。共焦点タイムラプスイメージングとパッチクランプ記録を同時に開始するには、2つの異なるソフトウェアアプリケーションで[スタート]ボタンをクリックします。
記録後、データが保存されていることを確認します。保持電位をゼロミリボルトに戻します。ピペットをバス溶液から取り出して廃棄します。
製造元または付属のソフトウェアで生のイメージングファイルを開きます。プロセスに移動し、ProcessToolsをクリックし、ツールを使用して各タイムラプス画像のローリング平均ファイルを生成します。これらのファイルを保存します。
定量化で、[ツール]に移動し、[スタックプロファイル]ボタンをクリックして、刺激の前後の時間ポイントを確認し、各チャンネルの蛍光変化を特定します。[楕円を描画] ボタンをクリックして、フュージョン イベントの対象領域を丸で囲みます。画像を右クリックし、[ROIを保存]をクリックして保存します。
「プロジェクトを開く」をクリックして、生ファイルを見つけます。画像を右クリックし、[ROIのロード]をクリックしてROIファイルを生のイメージングファイルにロードし、蛍光強度を測定します。[ツール]に移動し、ソフトウェアの[ROIのソート]をクリックし、各ROIの3つのチャネルすべてのトレースをプロットします。
[レポート] をクリックして、デジタル データや各 ROI のイメージング トレースなどの ROI データをファイル フォルダーに保存します。全細胞パッチクランプ記録および80〜10ミリボルトの1秒間の脱分極の適用を行い、エキソおよびエンドサイトーシスを呼び起こした。印加された脱分極は、内向きのカルシウム電流を誘導し、静電容量ジャンプはエキソサイトーシスを示し、ジャンプ後の静電容量減衰はエンドサイトーシスを示す。
細胞底部でのタイムラプスイメージングでは、1秒間の脱分極プロトコルによって誘導された融合事象は、FFN511放出を反映したFFN減少として示され、FPHおよびA655スポット蛍光増加を伴い、原形質膜および浴液から融合小胞へのPH-mNGおよびA655拡散を反映する。この図は、F655調光と同定された密接な融合を示し、FPHは遅延して持続または崩壊した。この図は、PH-mNGおよびA655スポットの両方の存在によって検出されたステイフュージョンを表す。
この図は、PH-mNGスポットとA655スポットの平行なサイズ縮小を伴う平行FPHおよびF655崩壊として検出される収縮融着を表し、記録を成功させるには、パッチクランプでセル全体の構成を生成し、各チャネルに対して適切な蛍光強度でセル下部にイメージングする必要があります。ここで説明する電気生理学と超解像顕微鏡の組み合わせは、融合細孔ダイナミクスと神経回路を測定するための貴重なツールです。
