막 융합은 많은 생물학적 기능을 매개한다. 이 프로토콜은 융합 기공 개방 및 송신기 방출 역학을 감지하고 세 가지 융합 모드, 즉 근접 융합, 융합 유지 및 수축 융합을 구별하는 방법을 설명합니다. 공초점 현미경과 패치 클램프 기록의 조합은 융합 기공 개방 및 폐쇄의 시각화 및 동역학의 결정을 용이하게합니다.
크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다. 이 방법의 성공적인 구현은 건강한 일차 크로마핀 세포 배양, 충분한 플라스미드 형질감염 효율 및 높은 전기생리학적 기록 성공률을 생성하는 것과 같은 몇 가지 일반적인 단계에 의존한다. 표면에 상처 나 출혈이없는 세 개의 손상되지 않은 땀샘을 선택하고 가위로 지방 조직을 제거하십시오.
피가 나오지 않을 때까지 로크의 용액으로 관류하여 땀샘을 씻으십시오. 소화를 위해 땀샘이 부풀어 오르기 시작할 때까지 0.22 마이크로 미터 필터가 부착 된 30 밀리미터 주사기를 사용하여 부신 정맥을 통해 효소 용액을 주입하십시오. 그런 다음 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
다시 주사하고 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 소화 후, 땀샘을 부신 정맥에서 다른 쪽 끝으로 세로 자르고 가위로 선을 펼치십시오. 흰색 수질을 조각으로 묶어서 로크의 용액이 들어있는 10 센티미터 페트리 접시에 넣으십시오.
가위로 수질을 자르고 다듬습니다. 수질 현탁액을 80 ~ 100 마이크로미터 나일론 메쉬로 비이커에 걸러냅니다. 여액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 48 x g 실온에서 3 분 동안 원심분리하여 세 가지 감속으로 삼십시.
원심분리 후, 상층액을 제거하고 피펫팅에 의해 로크의 용액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 80 내지 100 마이크로미터 스트레이너로 여과하고, 감속 세 개로 3분 동안 48 x g 실온에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 30 밀리리터의 배양 배지로 재현탁시켰다.
혈구계 계수 챔버를 사용하여 세포 번호를 결정하십시오. 2, 800, 000 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세 개의 감속과 함께 두 분 동안 48 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.
제조업체가 제공 한 100 마이크로 리터의 transection 버퍼를 세포 펠렛에 첨가하십시오. 이어서, 두 마이크로그램의 PH-mNG 플라스미드를 첨가한다. 용액을 위아래로 파이핑하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 지체없이 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.
즉시 큐벳을 전기 천공기로 옮기고 화면 목록에서 005 프로그램을 선택한 다음 Enter 키를 눌러 전기 천공을 수행하십시오. 전기 천공 후, 즉시 큐벳에 1.8 밀리리터의 배지를 넣고 멸균 팁이 장착 된 마이크로 피펫으로 부드럽게 섞으십시오. 전기천공된 전지의 현탁액 300 마이크로리터를 각 접시의 커버 슬립 상에 넣고 하나의 전기천공 반응을 위해 총 다섯 개에서 여섯 개의 접시를 도금한다.
조심스럽게 접시를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 옮겨 9 % 이산화탄소로 30 분 동안 옮기고 30 분 후에 각 접시에 두 밀리리터의 미리 데운 배지를 부드럽게 첨가하십시오. 붕규산 유리 모세 혈관에서 패치 피펫을 피펫 풀러로 당기고 액체 왁스로 팁을 코팅하고 마이크로 단조로 연마하여 준비하십시오. 패치 클램프 기록 증폭기를 켜고 소프트웨어를 시작하십시오.
소프트웨어의 적절한 칼슘 전류 및 정전 용량 기록 매개 변수를 설정하십시오. 자극이 10초에서 시작되는 총 60초 지속 시간의 기록 프로토콜을 설정합니다. 전압 클램프 기록의 유지 전위를 80밀리볼트로 설정합니다.
칼슘 유입과 커패시턴스 점프를 유도하는 자극으로 영하 80밀리볼트에서 10밀리볼트로 1초 탈분극을 설정합니다. 공초점 현미경 시스템을 켜고 소프트웨어에서 적절한 매개 변수를 설정하십시오. 458 나노미터, 514 나노미터 및 633 나노미터를 포함한 레이저를 켜고 각 형광 프로브에 따라 각 레이저의 방출 수집 범위를 설정하십시오.
좋은 세포 상태와 적절한 발현을 가진 접시를 선택하고 접시의 배지에 두 마이크로 리터의 형광 거짓 신경 전달 물질 FFN511을 첨가하십시오. 접시를 20 분 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오. FFN511을 로딩 한 후, 기록 챔버를 준비하고 50 마이크로리터의 욕조 용액에 두 마이크로리터의 형광 염료 A655를 첨가한다.
접시에서 커버 슬립을 핀셋으로 녹음 챔버로 옮기고 즉시 A655 함유 욕조 용액을 추가하십시오. 100X 오일 침지 목표에 오일 한 방울을 놓습니다. 챔버를 현미경에 장착하고 조정 손잡이를 사용하여 오일이 커버 슬립의 바닥에 닿을 수 있도록하십시오.
세포에 초점을 맞추고 밝은 필드 및 공초점 이미징을 사용하여 mNG 발현이 있는 적합한 세포를 찾습니다. 선택한 셀을 확대하고 시야에 가운데에 배치하여 빈 영역을 최소화합니다. 최소화된 시간 간격으로 FFN511, PH-mNG 및 A665의 고정된 Z-평면에서 XY 평면 공초점 이미징에 대한 파라미터를 설정합니다.
미세 조정 손잡이로 초점을 셀 하단으로 조정합니다. 소프트웨어에서 여기 레이저 파워를 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 얻고 상당한 형광 표백을 피할 수 있는 설정을 찾으십시오. 아홉 마이크로리터의 내부 용액을 패치 피펫에 넣고 피펫을 패치 클램프 증폭기 스테이지의 홀더에 부착합니다.
주사기로 소량의 양압을 가하고 피펫 팁을 움직여 미세 조작기로 목욕 용액을 만지십시오. 증폭기가 전압 펄스 테스트를 통해 피펫 저항이 대략 두 메가옴에서 네 메가옴 사이에 있음을 보여 주는지 확인하십시오. LJ/Auto를 눌러 액체 접합부를 취소합니다.
미세 조작기를 사용하여 피펫을 선택한 셀 쪽으로 이동합니다. 셀 부착 모드를 형성하려면 피펫 팁을 움직여 셀을 터치합니다. 주사기로 부드러운 음압을 가하면서 유지 전위를 0에서 영하 80 밀리볼트로 변경하십시오.
저항이 한 기가옴을 통과하면 구성이 안정화될 때까지 약 30초 동안 기다립니다. C-fast/Auto를 눌러 빠른 정전 용량을 보정합니다. 도매 모드를 형성하려면 막이 파열 될 때까지 주사기로 짧지 만 강력한 음압 펄스를 적용하십시오.
C-slow/Auto를 눌러 느린 정전 용량을 보정합니다. 이미징 초점을 약간 조정하여 셀 바닥에 초점을 맞춥니다. 공초점 시간 경과 이미징과 패치 클램프 기록을 동시에 시작하려면 두 개의 서로 다른 소프트웨어 응용 프로그램이 있는 시작 단추를 클릭합니다.
녹음 후 데이터가 저장되었는지 확인하십시오. 보류 전위를 다시 0밀리볼트로 변경합니다. 피펫을 욕조 용액에서 꺼내어 버리십시오.
제조업체 또는 제공된 소프트웨어에서 원시 이미징 파일을 엽니다. 프로세스로 이동하여 ProcessTools를 클릭하고 도구를 사용하여 경과 할 때마다 이미지에 대한 롤링 평균 파일을 생성하십시오. 이러한 파일을 저장합니다.
정량화에서 도구로 이동하여 스택 프로파일 버튼을 클릭하여 자극 전후의 시점을 확인하고 각 채널의 형광 변화를 확인하십시오. 타원 그리기 버튼을 클릭하여 퓨전 이벤트의 관심 영역을 원으로 돌립니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 저장을 클릭하여 저장합니다.
프로젝트 열기를 클릭하여 원시 파일을 찾습니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 로드를 클릭하여 ROI 파일을 원시 이미징 파일에 로드하여 형광 강도를 측정합니다. 도구로 이동하여 소프트웨어에서 ROI 정렬을 클릭하고 각 ROI의 세 채널 모두에 대한 추적을 플로팅합니다.
보고서를 클릭하여 각 ROI에 대한 디지털 데이터 및 이미징 추적을 포함한 ROI 데이터를 파일 폴더에 저장합니다. 전체 세포 패치-클램프 기록 및 80 내지 10 밀리볼트의 1초 탈분극의 적용은 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키기 위해 수행되었다. 적용된 탈분극은 내측 칼슘 전류, 커패시턴스 점프, 엑소사이토시스를 나타내는 커패시턴스 점프, 및 점프 후 커패시턴스 붕괴를 유도하여 엔도사이토시스를 나타낸다.
세포 바닥에서의 시간 경과 영상화와 함께, 일초 탈분극 프로토콜에 의해 유도된 융합 이벤트는 FPH 및 A655 스팟 형광 증가를 수반하는 FFN511 방출을 반영하는 FFN 감소로 표시되었고, 원형질막으로부터 PH-mNG 및 A655 확산을 반영하고 욕조 용액이 융합된 소포 내로 반영되었다. 이 그림은 F655 디밍으로 식별된 근접 융합을 나타내는 반면, FPH는 지연으로 지속되거나 붕괴됩니다. 도면은 PH-mNG 및 A655 스팟 둘 다의 존재에 의해 검출된 체류 융합을 나타낸다.
이 그림은 PH-mNG 스폿과 A655 스팟의 병렬 크기 감소를 수반하는 병렬 FPH 및 F655 붕괴로 검출된 수축 융합을 나타내며 성공적인 기록은 패치 클램프로 전체 셀 구성을 생성하고 각 채널에 대해 적절한 형광 강도로 셀 하단에서 이미징해야 합니다. 여기에 설명 된 전기 생리학과 초분해능 현미경의 조합은 융합 기공 역학 및 신경 회로를 측정하는 데 유용한 도구입니다.
