يتوسط الانصهار الغشائي العديد من الوظائف البيولوجية. يصف هذا البروتوكول طريقة للكشف عن فتح مسام الاندماج وديناميكيات إطلاق جهاز الإرسال والتمييز بين ثلاثة أوضاع اندماج ؛ الاندماج القريب ، والاندماج البقي ، وتقليص الانصهار. يسهل الجمع بين المجهر البؤري وتسجيل المشبك الرقعة تصور فتح المسام الانصهارية وإغلاقها وتحديد حركياتها.
على الرغم من وصفه لخلايا الكرومافين ، إلا أنه يمكن تطبيق مبدأ الطريقة الموصوفة هنا على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين. يعتمد التنفيذ الناجح لهذه الطريقة على عدة خطوات عامة ، مثل توليد مزرعة خلايا كرومافين أولية صحية ، وكفاءة كافية في نقل البلازميد ، ومعدل نجاح تسجيل كهروفسيولوجي مرتفع. اختر ثلاث غدد سليمة دون جروح أو نزيف على السطح وقم بإزالة الأنسجة الدهنية بالمقص.
اغسل الغدد عن طريق التروية بمحلول لوك حتى لا يخرج الدم. للهضم ، حقن محلول الإنزيم من خلال الوريد الكظري باستخدام حقنة 30 ملم متصلة بمرشح 0.22 ميكرومتر حتى تبدأ الغدة في الانتفاخ. ثم اترك الغدد عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
حقن مرة أخرى وترك الغدد في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى. بعد الهضم ، اقطع الغدة طوليا من الوريد الكظري إلى الطرف الآخر بمقص لكشف الغدة. اعزل النخاع الأبيض عن طريق ملاقطه على شكل قطع في طبق بتري بطول 10 سنتيمترات يحتوي على محلول لوك.
قطع وفرم النخاع بالمقص. قم بتصفية تعليق النخاع باستخدام شبكة نايلون من 80 إلى 100 ميكرومتر في دورق. انقل الترشيح إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند درجة حرارة الغرفة 48 × g لمدة ثلاث دقائق مع تباطؤ ثلاثة.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية بمحلول لوك عن طريق السحب. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة 80 إلى 100 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند درجة حرارة الغرفة 48 × g لمدة ثلاث دقائق مع التباطؤ ثلاثة. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 30 ملليلتر من وسط الثقافة.
حدد رقم الخلية باستخدام غرفة عد مقياس الدم. انقل 2،800،000 خلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 48 × g لمدة دقيقتين مع تباطؤ ثلاثة.
أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحويل الذي توفره الشركة المصنعة إلى بيليه الخلية. ثم أضف ميكروغرام من بلازميد PH-mNG. امزج التعليق بلطف عن طريق توصيل المحلول لأعلى ولأسفل ونقل الخليط إلى كوفيت كهربائي دون تأخير.
انقل الكوفيت على الفور إلى المسام الكهربائية ، وحدد برنامج 005 في قائمة الشاشة واضغط على Enter لإجراء الفحص الكهربائي. بعد الكهربية ، أضف على الفور 1.8 ملليلتر من الوسط إلى الكوفيت واخلطه بلطف مع ماصة صغيرة مجهزة بطرف معقم. أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلايا الكهربائية على زلة الغطاء في كل طبق مطلي من خمسة إلى ستة أطباق في المجموع لتفاعل كهربائي واحد.
انقل الأطباق بعناية إلى حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 9٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة وأضف بلطف ملليلترين من الوسط الدافئ مسبقا إلى كل طبق بعد 30 دقيقة. تحضير ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات عن طريق سحبها باستخدام مجتذب ماصة ، وطلاء أطرافها بالشمع السائل ، وتلميعها باستخدام microforge. قم بتشغيل مضخم تسجيل مشبك التصحيح وابدأ تشغيل البرنامج.
قم بتعيين معلمات تسجيل تيار الكالسيوم والسعة المناسبة للبرنامج. قم بتعيين بروتوكول تسجيل مدته 60 ثانية في المجموع حيث يبدأ التحفيز في 10 ثوان. اضبط إمكانات الاحتفاظ لتسجيل مشبك الجهد على 80 مللي فولت.
اضبط إزالة الاستقطاب لمدة ثانية واحدة من ناقص 80 مللي فولت إلى 10 مللي فولت كحافز للحث على تدفق الكالسيوم وقفزة السعة. قم بتشغيل نظام المجهر البؤري وتعيين المعلمات المناسبة في البرنامج. قم بتشغيل أشعة الليزر ، بما في ذلك 458 نانومتر و 514 نانومتر و 633 نانومتر وتعيين نطاق جمع الانبعاثات لكل ليزر وفقا لكل مسبار فلوري.
اختر طبقا ذا حالة خلية جيدة وتعبيرا مناسبا وأضف ميكرولترين من الناقل العصبي الكاذب الفلوري FFN511 إلى الوسط الموجود في الطبق. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بعد تحميل FFN511 ، قم بإعداد غرفة التسجيل وإضافة ميكرولترين من صبغة التألق A655 إلى 50 ميكرولتر من محلول الحمام.
انقل زلة الغطاء من الطبق إلى غرفة التسجيل باستخدام ملاقط وأضف على الفور محلول الحمام الذي يحتوي على A655. ضع قطرة من الزيت على هدف غمر الزيت 100X. قم بتركيب الغرفة في المجهر واستخدم مقبض الضبط لجعل الزيت يلامس الجزء السفلي من الغطاء فقط.
اجعل الخلايا في بؤرة التركيز واستخدم التصوير الميداني وبؤري الساطع للعثور على خلية مناسبة مع تعبير mNG. قم بتكبير الخلية المحددة وتوسيطها في مجال الرؤية ، مما يقلل من المناطق الفارغة. قم بتعيين معلمات للتصوير البؤري لمستوى XY على مستوى Z ثابت من FFN511 وPH-mNG وA665 مع فاصل زمني مصغر.
اضبط التركيز البؤري على الجزء السفلي من الخلية باستخدام مقبض ضبط دقيق. اضبط طاقة ليزر الإثارة في البرنامج للعثور على إعداد للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء وتجنب التبييض الفلوري الكبير. أضف تسعة ميكرولترات من المحلول الداخلي إلى ماصة التصحيح وقم بتوصيل الماصة بحامل مرحلة مضخم مشبك التصحيح.
ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي باستخدام حقنة وحرك طرف الماصة للمس محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق. تأكد من أن مكبر الصوت يظهر أن مقاومة الماصة تتراوح تقريبا بين اثنين إلى أربعة ميجا أوم مع اختبار نبض الجهد. اضغط على LJ/Auto لإلغاء الوصلة السائلة.
حرك الماصة نحو الخلية المحددة باستخدام جهاز مناور دقيق. لتشكيل وضع متصل بالخلية، حرك طرف الماصة للمس الخلية. قم بتغيير إمكانات الثبات من صفر إلى ناقص 80 مللي فولت أثناء تطبيق ضغط سلبي لطيف باستخدام حقنة.
بمجرد أن تتجاوز المقاومة جيجا أوم واحد ، انتظر لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يستقر التكوين. اضغط على C-fast/Auto للتعويض عن السعة السريعة. لتشكيل وضع البيع بالجملة ، ضع نبضات قصيرة ولكنها قوية من الضغط السلبي باستخدام المحقنة حتى يتمزق الغشاء.
اضغط على C-slow/Auto للتعويض عن السعة البطيئة. اضبط تركيز التصوير قليلا للتركيز على قاع الخلية. ابدأ تصوير الفاصل الزمني البؤري وتسجيل مشبك التصحيح في وقت واحد بالنقر فوق الزرين "ابدأ" مع تطبيقين برمجيين مختلفين.
بعد التسجيل ، تأكد من حفظ البيانات. تغيير إمكانات الكبح إلى الصفر مللي فولت. حرك الماصة خارج محلول الحمام وتخلص منها.
افتح ملفات التصوير الخام مع أي شركة مصنعة أو برنامج مزود. انتقل إلى العملية ، وانقر فوق ProcessTools واستخدم الأدوات لإنشاء ملفات متوسطة متداولة لكل صورة بفاصل زمني. احفظ هذه الملفات.
ضمن تحديد كمي ، انتقل إلى الأدوات وانقر فوق أزرار ملف تعريف المكدس للتحقق من النقاط الزمنية قبل وبعد التحفيز وتحديد تغييرات التألق في كل قناة. انقر على زر رسم القطع الناقص لوضع دائرة حول المناطق ذات الأهمية لأحداث الانصهار. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق حفظ عائد الاستثمار للحفظ.
انقر فوق فتح المشاريع لتحديد موقع الملف الخام. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق تحميل عائد الاستثمار لتحميل ملف عائد الاستثمار في ملف التصوير الخام لقياس كثافة التألق. انتقل إلى الأدوات وانقر على فرز عائد الاستثمار في البرنامج وارسم الآثار لجميع القنوات الثلاث لكل عائد استثمار.
انقر فوق تقرير لحفظ بيانات عائد الاستثمار، بما في ذلك البيانات الرقمية وآثار التصوير لكل عائد استثمار في مجلد ملف. تم إجراء تسجيل مشبك رقعة الخلية بالكامل وتطبيق إزالة الاستقطاب لمدة ثانية واحدة من 80 إلى 10 مللي فولت لاستحضار الإكسو وكثرة الخلايا الداخلية. أدى الاستقطاب المطبق إلى تيار الكالسيوم الداخلي ، وقفزة السعة ، مما يشير إلى إفرازات الخلايا الخارجية ، واضمحلال السعة بعد القفزة ، مما يشير إلى اندوسيتوسيس.
مع تصوير الفاصل الزمني في قاع الخلية ، تمت الإشارة إلى أحداث الاندماج الناجمة عن بروتوكول إزالة الاستقطاب لمدة ثانية واحدة على أنها انخفاض FFN يعكس إطلاق FFN511 ، مصحوبا بزيادة التألق الموضعي FPH و A655 ، مما يعكس انتشار PH-mNG و A655 من غشاء البلازما ومحلول الحمام في حويصلة الصهر. يقدم الشكل اندماجا وثيقا تم تحديده على أنه تعتيم F655 ، في حين أن FPH استمر أو تحلل مع تأخير. يمثل الشكل اندماج البقاء المكتشف من خلال وجود كل من بقع PH-mNG و A655.
يمثل الشكل اندماج الانكماش المكتشف على أنه اضمحلال متوازي FPH و F655 مصحوبا بتقليل الحجم المتوازي لبقعة PH-mNG وبقعة A655 يتطلب التسجيل الناجح توليد تكوين الخلية بالكامل باستخدام مشبك التصحيح والتصوير في قاع الخلية بكثافة فلورسنت مناسبة لكل قناة. يعد الجمع بين الفيزيولوجيا الكهربية والفحص المجهري فائق الدقة الموصوف هنا أداة قيمة لقياس ديناميكيات مسام الاندماج والدوائر العصبية.
