该协议比较了来自APP / PS1转基因小鼠的全部分感兴趣和脑部分感兴趣的亚区域的淀粉样蛋白 - β斑块负载。该特定方案中呈现的方法和结果将使读者或研究人员能够在感兴趣的完整区域或感兴趣的子区域之间进行选择，以确定小鼠大脑切片中的β负荷。首先，下载图像分析软件。
安装后，启动软件并单击文件，然后打开并选择要分析的图像。从软件工具栏中，选择直线工具，然后沿比例尺的长度绘制一条直线。单击分析，然后单击设置比例选项卡。
再次单击分析，然后测量选项卡以记下比例尺的长度或距离（以像素为单位）。在弹出窗口中，输入以像素为单位的距离、比例尺的已知距离，然后输入以微米为单位的长度单位。然后，选中全局框以将新比例设置应用于所有后续图像（如果处理了多个图像）。
单击“确定”以应用设置。要将所需测量值设置为截面面积，请转到分析，然后设置测量值，然后选择面积和显示标签框。确保在“重定向到”选项卡下选择了正在分析的图像。
为了便于海马体或皮层可视化，请转到图像并调整亮度或对比度。将最大滑动条逐渐向左拖动以提高组织清晰度，直到可以识别感兴趣的大脑区域或 ROI。使用多边形或手绘选择工具勾勒出海马体区域的轮廓。
勾勒出区域轮廓后，单击亮度或对比度设置的重置选项以恢复到原始亮度。要测量所选区域的总组织面积，请单击编辑并清除外部。一旦所选区域成为屏幕上的唯一图像，单击分析，然后测量选项卡以获得弹出窗口中分析的总组织面积。
然后，将数据保存在 Excel 文件中。要测量 6-E10 染色的正区域，请按顺序转到图像、调整和着色阈值选项卡。阈值方法下的预制滤波器提供所需的结果，以红色突出显示最强的信号。
选择适当的阈值后，检查深色背景以突出显示黑色背景上的淀粉样蛋白β斑点。单击选择，然后原始，然后再次选择，在白色背景上给出淀粉样蛋白β沉积物的黑暗信号。弹出窗口生成后，单击“分析和分析粒子”选项卡，然后单击“确定”。通过单击编辑和复制按钮复制软件生成的摘要输出。
然后，使用各自的标签粘贴到以前启动的Excel文件中。使用公式计算百分比6E-10阳性区域 下载图像分析软件后，执行步骤，直到大脑ROI可识别，如前所述。然后，使用矩形工具，选择皮层或海马体中的 ROI。
在工具栏中，单击“编辑”，然后选择并指定选项卡，将高度和宽度更改为预定义的值。调整盒子，使其完全被纸巾覆盖。将亮度或对比度重置为原始亮度。
通过右键单击框并单击复制项来复制选定的ROI。将打开一个包含所选区域的新窗口。重命名复制的图像以显示其所在的区域。
使用工具栏并单击图像来调整复制的图像类型，然后键入 8 位键以将复制的 RGB 图像转换为 8 位，以便最好地分析斑块。通过单击编辑来反转图像，然后反转。要测量6E-10正区域，请转到图像，然后进行调整和阈值。
阈值方法下的预定义滤波器将提供所需的结果，以红色突出显示最强的信号。选择适当的阈值后，按应用。要分析 6E-10 正区域，请使用工具栏并单击“分析和分析粒子”选项卡，确保选中汇总结果。
通过单击编辑和复制选项卡复制带有百分比区域的摘要输出。然后，将摘要输出粘贴到具有相应标签的以前启动的Excel文件中。对组织中的不同区域重复该过程，确保每个框的位置以勾勒出每个图像之间的ROI是一致的。
在该代表性评估中，比较全ROI分析方法和亚ROI分析方法，以量化皮层和海马体脑组织中的6E-10阳性区域。完整的投资回报率分析涉及概述整个投资回报率。相比之下，子ROI分析涉及在ROI中选择预定义的区域。
此处显示了完整和子ROI 6E-10正面积量化的逐步过程，以及用于子ROI量化的ROI轮换。此处演示了完整 ROI 分析与子 ROI 分析之间的相关性。在对皮层和海马体进行亚ROI分析的两位读者报告的6E-10阳性区域之间观察到显着的正相关。
此外，平均子ROI 6E-10正区域与使用完整ROI获得的区域具有很强的正相关关系。对于平均6E-10阳性区域，在亚ROI分析中，在皮质和海马体中未观察到显着差异。Eliza观察到全脑匀浆和可溶性淀粉样蛋白β-42测量之间存在显着相关性，并且来自研究阈值选择的完整ROI分析是获得准确数据量化的关键。
需要用户干预，以确保使用所选过滤器准确选择阳性染色剂。除了β淀粉样蛋白定量外，该方法还可用于其他荧光免疫染色剂。例如，Iba-1，来自小胶质细胞阳性区域定量。
