Bu protokol, APP / PS1 transgenik farelerden beyin bölümlerinde ilgi alanlarının tam bölümlerinde ve ilgi alanlarının alt bölgelerinde amiloid-beta plak yükünü karşılaştırır. Bu özel protokolde sunulan yöntem ve sonuçlar, okuyucuların veya araştırmacıların, fare beyin bölümlerinde bir beta yükünü belirlemek için tam ilgi alanı veya alt ilgi alanı analizi arasında seçim yapmalarını sağlayacaktır. Başlamak için görüntü analiz yazılımını indirin.
Kurulumdan sonra, yazılımı başlatın ve dosyaya tıklayın, ardından analiz edilecek görüntüyü açın ve seçin. Yazılım araç çubuğundan düz aracı seçin ve ölçek çubuğunun uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin. Analize tıklayın, ardından ölçek ayarla sekmelerine tıklayın.
Yine, analize tıklayın, ardından ölçek çubuğunun uzunluğunu veya mesafesini piksel cinsinden not etmek için sekmeleri ölçün. Açılır pencerede, mesafeyi piksel cinsinden, ölçek çubuğunun bilinen mesafesini girin ve uzunluk birimini mikrometre olarak girin. Ardından, birden fazla görüntü işleniyorsa, yeni ölçek ayarını aşağıdaki tüm görüntülere uygulamak için genel kutuyu işaretleyin.
Ayarları uygulamak için Tamam'ı tıklatın. İstediğiniz ölçümü bölümün alanına ayarlamak için analize gidin, ardından ölçümleri ayarlayın ve alanı seçin ve etiket kutularını görüntüleyin. Analiz edilen görüntünün Yeniden Yönlendir sekmesi altında seçildiğinden emin olun.
Hipokampus veya korteks görselleştirme kolaylığı için görüntüye gidin ve parlaklığı veya kontrastı ayarlayın. Beynin ilgilendiği bölgeler veya yatırım getirisi tanımlanana kadar doku netliğini artırmak için maksimum kaydırma çubuğunu kademeli olarak sola sürükleyin. Hipokampus bölgesini özetlemek için çokgen veya serbest el seçim aracını kullanın.
Bölge ana hatlarıyla belirtildikten sonra, orijinal parlaklığa geri dönmek için parlaklık veya kontrast ayarlarının sıfırlama seçeneğine tıklayın. Seçilen bölgenin toplam doku alanını ölçmek için, düzenle'ye tıklayın ve dışarıyı temizleyin. Seçilen bölge ekrandaki tek görüntü olduğunda, analiz etmeyi tıklayın, ardından bir açılır pencerede analiz edilen toplam doku alanını elde etmek için ölçüm sekmelerini tıklayın.
Ardından, verileri bir Excel dosyasına kaydedin. 6-E10 lekeli pozitif alanı ölçmek için sırayla görüntü, ayar ve renk eşiği sekmelerine gidin. Eşik yönteminin altında önceden hazırlanmış bir filtre, en güçlü sinyalleri kırmızı renkte vurgulayarak istenen sonuçları sağlar.
Uygun eşiği seçtikten sonra, siyah bir arka plan üzerinde amiloid beta noktalarını vurgulamak için koyu arka planı kontrol edin. Seç, ardından orijinal üzerine tıklayın ve beyaz bir arka plan üzerinde amiloid beta birikintilerinin karanlık sinyallerini vererek tekrar seçin. Açılır pencere oluşturulduğunda, parçacıkları analiz et ve analiz et sekmesine tıklayın ve Tamam'a basın. Düzenle ve kopyala düğmelerine tıklayarak yazılım tarafından oluşturulan özet çıktıyı kopyalayın.
Ardından, daha önce başlatılmış Excel dosyasına ilgili etiketlerle yapıştırın. Formülü kullanarak yüzde 6E-10 pozitif alanını hesaplayın Görüntü analiz yazılımını indirdikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, beyin yatırım getirisi tanımlanabilir olana kadar adımları uygulayın. Ardından, dikdörtgen aracını kullanarak, korteksteki veya hipokampustaki yatırım getirisini seçin.
Araç çubuğunda, düzenle'ye tıklayın, ardından yüksekliği ve genişliği önceden tanımlanmış bir değere dönüştüren sekmeyi seçin ve belirtin. Kutuyu tamamen doku tarafından kaplanacak şekilde ayarlayın. Parlaklığı veya kontrastı orijinal parlaklığa sıfırlayın.
Seçilen YG'yi kutuya sağ tıklayıp kopyaya tıklayarak çoğaltın. Seçilen bölgeyi içeren yeni bir pencere açılacaktır. Çoğaltılan görüntüyü, bulunduğu bölgeyi görüntüleyecek şekilde yeniden adlandırın.
Araç çubuğunu kullanarak ve görüntüye tıklayarak çoğaltılan görüntü türünü ayarlayın, ardından plakları en iyi şekilde analiz etmek için çoğaltılan RGB görüntüsünü 8 bit'e dönüştürmek için 8 bit tuşlar yazın. Düzenle'yi tıklayarak görüntüyü tersine çevirin, ardından ters çevirin. 6E-10 pozitif alanını ölçmek için görüntüye gidin, ardından ayarlayın ve eşik değerini belirleyin.
Eşik yönteminin altında önceden tanımlanmış bir filtre, en güçlü sinyalleri kırmızı renkle vurgulayarak istenen sonuçları sağlayacaktır. Uygun eşiği seçtikten sonra uygula'ya basın. 6E-10 pozitif alanını analiz etmek için, araç çubuğunu kullanın ve parçacıkları analiz et ve analiz et sekmelerine tıklayarak özetleme sonuçlarının kontrol edildiğinden emin olun.
Düzenle ve kopyala sekmelerine tıklayarak özet çıktısını yüzde alanıyla kopyalayın. Ardından, özet çıktısını ilgili etiketlerle önceden başlatılmış Excel dosyasına yapıştırın. Dokudaki farklı bölgeler için prosedürü tekrarlayın ve YG'yi ana hatlarıyla belirtmek için her kutunun yerleştirilmesinin her görüntü arasında tutarlı olmasını sağlayın.
Bu temsili değerlendirmede, korteks ve hipokampus beyin dokularındaki 6E-10 pozitif alanı ölçmek için tam ve alt ROI analiz yöntemleri karşılaştırılır. Tam ROI analizi, tüm ROI'nin ana hatlarını çizmeyi içerir. Buna karşılık, alt ROI analizi, ROI içinde önceden tanımlanmış bir bölgenin seçilmesini içerir.
Tam ve alt ROI 6E-10 pozitif alan ölçümü için kademeli prosedür, alt ROI ölçümü için ROI rotasyonu ile burada gösterilmiştir. Tam ve alt ROI analizleri arasındaki korelasyon burada gösterilmiştir. Korteks ve hipokampus için alt ROI analizi yapan iki okuyucu tarafından bildirilen 6E-10 pozitif alan arasında anlamlı bir pozitif korelasyon gözlenmiştir.
Ayrıca, ortalama alt ROI 6E-10 pozitif alanı, tam ROI kullanılarak elde edilen alanla güçlü, anlamlı bir pozitif korelasyon paylaştı. Alt ROI analizlerinde ortalama 6E-10 pozitif alan için, korteks ve hipokampusta anlamlı bir fark gözlenmedi. Eliza tarafından tüm beyin homojenatı ve çözünür amiloid beta 1-42 ölçümleri arasında anlamlı bir korelasyon gözlendi ve çalışmadan tam ROI analizi Eşik seçimi doğru veri ölçümü elde etmede anahtardır.
Pozitif lekelerin seçilen filtreyle doğru bir şekilde seçilmesini sağlamak için kullanıcı müdahalesi gerekir. Amiloid beta miktarının yanı sıra, bu yöntem diğer floresan immüno-lekeleri için de kullanılabilir. Örneğin, Iba-1, mikroglial pozitif alan niceliğinden.
