Este protocolo compara a carga de placa amilóide-beta em seções completas de interesse e sub-regiões de interesse em seções cerebrais de camundongos transgênicos APP/PS1. O método e os resultados apresentados neste protocolo em particular permitirão que os leitores ou pesquisadores escolham entre a região completa de interesse ou a análise de interesse sub-região para determinar uma carga beta em seções cerebrais do mouse. Para começar, baixe o software de análise de imagens.
Após a instalação, inicie o software e clique no arquivo e, em seguida, abra e escolha a imagem a ser analisada. Na barra de ferramentas de software, selecione a ferramenta reta e desenhe uma linha reta ao longo do comprimento da barra de escala. Clique na análise e clique nas guias de escala definidas.
Novamente, clique na análise e, em seguida, meça guias para observar o comprimento ou distância da barra de escala em pixels. Na janela pop-up, entre na distância em pixels, a distância conhecida da barra de escala, e entre na unidade de comprimento como um micrômetro. Em seguida, verifique a caixa global para aplicar a nova configuração de escala a todas as imagens a seguir, se várias imagens forem processadas.
Clique em OK para aplicar as configurações. Para definir a medição desejada na área da seção, vá analisar, em seguida, definir as medidas e selecione as caixas de etiqueta de área e exibição. Certifique-se de que a imagem que está sendo analisada esteja selecionada na guia Redirecionar para.
Para facilitar a visualização do hipocampo ou córtex, vá até a imagem e ajuste o brilho ou o contraste. Arraste a barra de slides máxima gradualmente para a esquerda para aumentar a clareza tecidual até que as regiões de interesse do cérebro ou ROI sejam identificáveis. Use a ferramenta de seleção de polígono ou à mão livre para delinear a região do hipocampo.
Uma vez que a região esteja delineada, clique na opção redefinir as configurações de brilho ou contraste para reverter ao brilho original. Para medir a área total do tecido da região selecionada, clique na edição e limpe o lado de fora. Uma vez que a região selecionada seja a única imagem na tela, clique na análise e, em seguida, meça guias para obter a área total do tecido analisada em uma janela pop-up.
Em seguida, salve os dados em um arquivo Excel. Para medir a área positiva manchada 6-E10, vá para as guias de imagem, ajuste e limiar de cor em ordem. Um filtro pré-fabricado sob o método de limiar fornece resultados desejados destacando os sinais mais fortes em vermelho.
Depois de selecionar o limiar apropriado, verifique o fundo escuro para destacar as manchas beta amiloides em um fundo preto. Clique no select, em seguida, original e novamente selecione, dando os sinais escuros de depósitos beta amiloides em um fundo branco. Quando a janela pop-up for gerada, clique na guia analisar e analisar partículas e acerte OK. Copie a saída de resumo gerada pelo software clicando nos botões de edição e cópia.
Em seguida, cole o arquivo Excel iniciado anteriormente com respectivas etiquetas. Calcule a porcentagem 6E-10 área positiva usando a fórmula Depois de baixar o software de análise de imagem, execute as etapas até que o ROI cerebral seja identificável, como demonstrado anteriormente. Em seguida, usando a ferramenta retângulo, selecione o ROI no córtex ou no hipocampo.
Na barra de ferramentas, clique em editar e, em seguida, seleção e especifique a guia alterando a altura e a largura para um valor predefinido. Ajuste a caixa para que ela esteja totalmente coberta pelo tecido. Reinicie o brilho ou contraste com o brilho original.
Duplique o ROI selecionado clicando com o botão direito do mouse na caixa e clicando na duplicata. Uma nova janela com a região selecionada será aberta. Renomeie a imagem duplicada para exibir a região em que está localizada.
Ajuste o tipo de imagem duplicada usando a barra de ferramentas e clicando na imagem e, em seguida, digite teclas de 8 bits para converter a imagem RGB duplicada em 8 bits, para analisar melhor as placas. Inverta a imagem clicando em editar e, em seguida, inverta. Para medir a área positiva 6E-10, vá até a imagem, em seguida, ajuste e limite.
Um filtro predefinido sob o método de limiar fornecerá resultados desejados, destacando os sinais mais fortes em vermelho. Depois de selecionar o limiar apropriado, pressione aplicar. Para analisar a área positiva 6E-10, use a barra de ferramentas e clique nas guias de análise e análise de partículas, garantindo que os resultados do resumo sejam verificados.
Copie a saída de resumo com a área de porcentagem clicando nas guias editar e copiar. Em seguida, cole a saída de resumo no arquivo Excel iniciado anteriormente com as respectivas etiquetas. Repita o procedimento para as diferentes regiões do tecido, garantindo que a colocação de cada caixa para delinear o ROI seja consistente entre cada imagem.
Nesta avaliação representativa, os métodos de análise completa e sub-ROI são comparados para quantificar a área positiva 6E-10 no córtex e nos tecidos cerebrais do hipocampo. A análise completa do ROI envolve delinear todo o ROI. Em contraste, a análise do sub ROI envolve a seleção de uma região predefinida dentro do ROI.
O procedimento stepwise para quantificação de área positiva total e sub ROI 6E-10, com rotação de ROI para quantificação de sub ROI, são mostrados aqui. A correlação entre as análises completa e sub-ROI é demonstrada aqui. Observou-se correlação positiva significativa entre a área positiva 6E-10 relatada pelos dois leitores que realizam a análise do sub ROI para o córtex e o hipocampo.
Além disso, a área média abaixo do ROI 6E-10 positiva compartilhou uma forte e significativa correlação positiva com a área obtida utilizando o ROI completo. Para a média 6E-10 área positiva pela totalidade nas análises sub ROI, não foi observada diferença significativa no córtex e no hipocampo. Observou-se correlação significativa entre as medidas beta 1-42 amiloides totalmente homogêneas e solúveis, por Eliza, e a análise completa do ROI do estudo A seleção de limiares é fundamental para obter uma quantificação precisa dos dados.
A intervenção do usuário é necessária para garantir que as manchas positivas sejam selecionadas com precisão com o filtro selecionado. Além da quantificação beta amiloide, este método pode ser usado para outras imuno-manchas fluorescentes. Por exemplo, Iba-1, da quantificação da área positiva microglial.
