이 프로토콜은 APP/PS1 트랜스제닉 마우스로부터의 뇌 절편에 대한 관심의 전체 섹션과 관심의 하위 영역에서의 아밀로이드-베타 플라크 부하를 비교한다. 이 특정 프로토콜에 제시된 방법 및 결과는 독자 또는 연구자가 마우스 뇌 섹션의 베타 부하를 결정하기 위해 전체 관심 영역 또는 관심 하위 영역 분석 중에서 선택할 수있게 해줍니다. 시작하려면 이미지 분석 소프트웨어를 다운로드하십시오.
설치가 끝나면 소프트웨어를 시작하고 파일을 클릭 한 다음 분석 할 이미지를 열고 선택하십시오. 소프트웨어 도구 모음에서 직선 도구를 선택하고 배율 막대의 길이를 따라 직선을 그립니다. 분석을 클릭 한 다음 설정된 배율 탭을 클릭하십시오.
다시 분석을 클릭 한 다음 탭을 측정하여 스케일 막대의 길이 또는 거리를 픽셀 단위로 기록하십시오. 팝업 창에서 거리(픽셀 단위)를 입력하고 배율 막대의 알려진 거리를 입력하고 길이 단위를 마이크로미터로 입력합니다. 그런 다음 전역 상자를 선택하여 여러 이미지가 처리되는 경우 다음 모든 이미지에 새 배율 설정을 적용합니다.
확인을 클릭하여 설정을 적용합니다. 원하는 측정값을 단면의 영역으로 설정하려면 분석으로 이동한 다음 측정을 설정하고 영역을 선택하고 레이블 상자를 표시합니다. 분석 중인 이미지가 다음으로 리디렉션 탭에서 선택되어 있는지 확인합니다.
해마 또는 피질 시각화의 용이성을 위해 이미지로 이동하여 밝기 또는 대비를 조정하십시오. 최대 슬라이드 바를 왼쪽으로 점진적으로 드래그하여 관심 있는 뇌 영역이나 ROI를 식별할 수 있을 때까지 조직의 선명도를 높입니다. 다각형 또는 자유형 선택 도구를 사용하여 해마 영역의 윤곽을 그립니다.
영역이 윤곽선이 지정되면 밝기 또는 대비 설정의 재설정 옵션을 클릭하여 원래 밝기로 되돌립니다. 선택한 영역의 전체 조직 영역을 측정하려면 편집을 클릭하고 외부를 지웁니다. 선택한 영역이 화면의 유일한 이미지가되면 분석을 클릭 한 다음 탭을 측정하여 팝업 창에서 분석 된 전체 조직 영역을 가져옵니다.
그런 다음 데이터를 Excel 파일에 저장합니다. 6-E10 염색된 포지티브 영역을 측정하려면 이미지, 조정 및 색상 임계값 탭으로 순서대로 이동합니다. 임계값 지정 방법으로 미리 만들어진 필터는 가장 강한 신호를 빨간색으로 강조 표시하는 원하는 결과를 제공합니다.
적절한 임계 값을 선택한 후 어두운 배경을 확인하여 검은 색 배경에서 아밀로이드 베타 반점을 강조 표시하십시오. 선택을 클릭 한 다음 원본을 클릭 한 다음 다시 선택하여 흰색 배경에 아밀로이드 베타 침착물의 어두운 신호를줍니다. 팝업 창이 생성되면 입자 분석 및 분석 탭을 클릭하고 확인을 누르십시오. 편집 및 복사 버튼을 클릭하여 소프트웨어에서 생성 된 요약 출력을 복사하십시오.
그런 다음 각 레이블을 사용하여 이전에 시작한 Excel 파일에 붙여 넣습니다. 수식을 사용하여 백분율 6E-10 긍정 영역을 계산하십시오 이미지 분석 소프트웨어를 다운로드 한 후 앞에서 설명한 것처럼 뇌 ROI가 식별 될 때까지 단계를 수행하십시오. 그런 다음 사각형 도구를 사용하여 피질 또는 해마에서 ROI를 선택하십시오.
도구 모음에서 편집을 클릭한 다음 높이와 너비를 미리 정의된 값으로 변경하는 탭을 선택하고 지정합니다. 상자가 조직에 완전히 덮여 있도록 상자를 조정하십시오. 밝기 또는 대비를 원래 밝기로 재설정합니다.
상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제본을 클릭하여 선택한 ROI를 복제하십시오. 선택한 지역이 있는 새 창이 열립니다. 복제된 이미지의 이름을 바꿔 해당 이미지가 있는 영역을 표시합니다.
도구 모음을 사용하여 이미지를 클릭하여 중복 된 이미지 유형을 조정 한 다음 8 비트 키를 입력하여 중복 된 RGB 이미지를 8 비트로 변환하여 플라크를 가장 잘 분석하십시오. 편집을 클릭하여 이미지를 반전시킨 다음 반전하십시오. 6E-10 양극 영역을 측정하려면 이미지로 이동 한 다음 조정하고 임계 값을 조정하십시오.
임계값 지정 방법 아래에 미리 정의된 필터는 원하는 결과를 제공하여 가장 강력한 신호를 빨간색으로 강조 표시합니다. 적절한 임계값을 선택한 후 apply(적용)를 누릅니다. 6E-10 포지티브 영역을 분석하려면 도구 모음을 사용하고 입자 분석 및 분석 탭을 클릭하여 요약 결과가 확인되는지 확인합니다.
편집 및 복사 탭을 클릭하여 요약 출력을 백분율 영역과 함께 복사합니다. 그런 다음 요약 출력을 각 레이블이 있는 이전에 시작한 Excel 파일에 붙여 넣습니다. 조직의 여러 영역에 대해 절차를 반복하여 ROI를 윤곽을 그리는 각 상자의 배치가 각 이미지 간에 일관되게 유지되도록 합니다.
이 대표적인 평가에서, 전체 및 하위 ROI 분석 방법은 피질 및 해마 뇌 조직에서 6E-10 양성 영역을 정량화하기 위해 비교된다. 전체 ROI 분석에는 전체 ROI를 요약하는 작업이 포함됩니다. 대조적으로, 서브 ROI 분석은 ROI 내에서 미리 정의된 영역을 선택하는 것을 포함한다.
하위 ROI 정량화를 위한 ROI 회전과 함께 전체 및 하위 ROI 6E-10 포지티브 영역 정량화를 위한 단계적 절차가 여기에 나와 있습니다. 전체 ROI 분석과 하위 ROI 분석 간의 상관 관계는 여기에서 설명합니다. 피질과 해마에 대한 서브 ROI 분석을 수행하는 두 독자에 의해 보고된 6E-10 양성 영역 사이에 유의한 양의 상관관계가 관찰되었다.
또한, 평균 서브 ROI 6E-10 양성 영역은 전체 ROI를 사용하여 얻은 영역과 강력하고 유의미한 양의 상관 관계를 공유했습니다. 서브 ROI 분석에서 전체에 의한 평균 6E-10 양성 영역의 경우, 피질과 해마에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. Eliza에 의해 전체 뇌 균질액과 가용성 아밀로이드 베타 1-42 측정 사이에 유의미한 상관 관계가 관찰되었으며, 연구 역치 선택으로부터의 전체 ROI 분석은 정확한 데이터 정량화를 얻는 데 중요합니다.
양성 얼룩이 선택된 필터로 정확하게 선택되도록 하기 위해 사용자 개입이 필요합니다. 아밀로이드 베타 정량화 외에도, 이 방법은 다른 형광 면역염색에 사용될 수 있다. 예를 들어, Iba-1, 미세아교세포 양성 영역 정량화.
