使用三维类器官培养物离 体 维持人胶质母细胞瘤细胞多样性

寻找胶质母细胞瘤的治疗方法具有挑战性，因为肿瘤中存在的细胞多样性以及不同微环境之间的相互作用。类器官可以帮助重建一些空间多样性，我们可以用它来更好地了解肿瘤的生物学。虽然传统的细胞培养方法倾向于产生均质的肿瘤细胞群，但类器官可以更好地模拟胶质母细胞瘤的分子和细胞多样性，并更好地模拟肿瘤内相互作用。

类器官可用于研究药物疗效和耐药机制。对临床治疗的耐药性可能只出现在类器官中，而不出现在传统的球体培养中，反映了这种疾病的临床现实。类器官可以帮助证明化学疗法的区域效应。

它们可用于发现新的利基特定疗法，也可以作为未来个性化医疗的预测工具。一些用于制造类器官的材料对温度敏感，忽视将这些材料保持在适当的温度会导致难以创建或维护类器官。通过将蜡纸从封口膜片上取下并将其放置在两个无菌 96 孔聚合酶链反应或 PCR 板之间，开始在培养罩下制备类器官模具。

确保封口膜内部清洁。对顶板施加均匀的压力，在封口膜上形成两毫米深的小酒窝，而不会产生孔洞。将盘子分开。

凹陷的封口膜会粘在顶板上。然后将顶板放在干冰上 30 秒。使用无菌镊子快速将封口膜从顶板上拉下。

冷冻封口膜更容易去除。将完成的封口膜模具放入有盖的无菌 10 厘米细胞培养皿中。为了从胶质母细胞瘤或GBM贴壁培养物中制备单细胞悬液，请从平板上除去用过的培养基。

然后在室温下向平板中加入两毫升细胞分离溶液，并将板在37度下孵育3分钟。在显微镜下确认细胞从平板上脱离后，加入8毫升完全神经基础培养基或NBMc培养基以中和细胞分离溶液。通过单个70微米细胞过滤器过滤悬浮液。

以 120 倍 G 的速度旋转细胞五分钟。然后除去上清液并将细胞重悬于一毫升NBMc中。 使用细胞非渗透染色剂计数单细胞悬液中的细胞。

为了从单细胞悬浮液制备类器官，将适量的富含层粘连蛋白的细胞外基质或lrECM添加到冰桶或冷块中的小离心管中。制备每个类器官含有20， 000个细胞的细胞混合物。彻底混合lrECM细胞悬液混合物，以避免细胞沉降，从而导致类器官形成不均匀。

接下来，小心地将 20 微升混合物移液到封口膜模具上，形成珍珠状液滴。确保每两到三个类器官冷却移液器吸头，以防止lrECM聚合。将所需数量的类器官移液到10厘米培养板中的封口膜模具上后，将类器官在37摄氏度下在细胞培养箱中孵育一至两个小时。

类器官固化后，使用P1000尖端用NBMc培养基轻轻冲洗类器官从封口膜模具上，并将它们收集到含有20毫升NBMc的新10厘米培养板中。 将培养板放入培养箱中，不摇晃四天。四天后，更换板中的培养基。

为此，在细胞培养板下方放置一张深色纸。倾斜盘子并等待 20 秒。当类器官完全沉降在培养皿底部时，用大开口玻璃移液管慢慢取出培养基。

添加新培养基后，将板放入培养箱中，以80 RPM的轨道振荡器，此后每两到三天更换一次培养基。使用光学显微镜观察类器官的生长。在中心视图中，早期类器官生长显示通过lrECM迁移和单细胞侵袭。

七周时的成熟类器官相对于一角硬币的大小。用磷酸化组蛋白H3对GBM类器官进行免疫组织化学染色，显示与核心相比，类器官周边具有棕色或紫色外观的高度增殖细胞。0.1%DMSO中类器官的细胞活力数据表明类器官内和类器官间的一致性。

注意类器官生物量和培养基酸化。如果类器官通过培养基的速度太快，请务必更频繁地更换培养基或在附加板之间拆分类器官。成熟的类器官可用于治疗实验，或包埋和切片以用于免疫组织化学或免疫荧光。

解离的类器官可用于FACS分析。这些类器官最近被用于三维功能筛选，以发现空间上不同的癌症干细胞生态位中必不可少的靶标。我们还使用这些模型在体内测试之前优先考虑不同的药物和疗法。