通过乙二胺四乙酸介导的脱粘性快速、经济高效、无酶地传代人多能干细胞在饲养细胞上

该方案为在饲养细胞上培养的人多能干细胞的无酶传代提供了一种快速、经济高效的方法。该方案的优点是它不需要昂贵的无饲养层培养基和生长底物，避免了酶完全解离的风险，并降低了干细胞过渡到引发状态的风险。Hege Brincker Fjerdingstad将展示该程序，他是挪威人类多能干细胞核心设施的日常经理。

开始将0.5×10的种子提高到6次方的人成纤维细胞，以下称为饲养细胞，在含有20毫升含有10%FBS的IMDM的T 75培养瓶中，以下称为饲养细胞培养基。当饲养细胞达到90%汇合度时，取出培养基并用10毫升DPBS洗涤细胞3次，以避免培养基中的因子抑制胰蛋白酶。向烧瓶中加入2毫升胰蛋白酶EDTA，在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育约5分钟，同时用肉眼观察饲养细胞的分离。

分离开始后，继续在显微镜下观察细胞的解离，以确保所有聚集体解离成单个细胞。接下来，向烧瓶中加入五毫升新鲜的预热饲养细胞培养基，使胰蛋白酶-EDTA失活，并通过移液轻轻悬浮饲养细胞。将细胞悬液转移到 15 毫升试管中，然后盖上试管并以 200 G 离心 5 分钟。

小心地取出酸盐，不要干扰沉淀，并将其重新悬浮在四毫升新鲜的饲养细胞培养基中。在确保饲养细胞完全重悬后，使用细胞计数室对其进行计数，并计算在 35 毫米组织培养皿上培养 HSC 和 HI PSC 所需的细胞数。接下来通过伽马辐照进行有丝分裂阻滞，将适当数量的饲养细胞转移到 50 毫升离心管中，并加入饲养细胞培养基至总体积为 5 毫升。

在室温下立即转运至伽马辐照机并辐照以有丝分裂地阻止细胞。一旦饲养层细胞在组织培养罩下有丝分裂阻滞，将细胞重新悬浮在饲养层细胞培养基中，以获得 1.5 x 10 的细胞浓度，提高到每毫升 5 次方。将 2 毫升饲养细胞悬浮液加入 35 毫米培养皿中，并将培养皿转移到 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中。

为了细胞均匀分布，在培养箱架上缓慢但牢固地向前和向后移动培养皿。然后暂停并执行相同的操作，然后关闭孵化器门。24 小时后，用含有 10% 血清替代物的 IMDM 替换饲养细胞培养基。

从含有有丝分裂阻滞的饲养细胞的培养皿中，在菌落转移前 30 分钟，用含有碱性纤维母细胞生长因子或 BFGF 的 1.2 毫升预热 HESC 培养基替换含有 10% 血清替代培养基的 IMDM。接下来，从含有HSC或HI PSCs的培养皿中取出培养基，并用一毫升DPBS洗涤菌落，以除去未附着的细胞和细胞碎片。加入一毫升 0.5 毫摩尔 EDTA，在 37 摄氏度下孵育一分钟。

然后使用一毫升移液管，用一毫升含有BFGF的HESC培养基代替EDTA溶液。用相同的移液管轻轻研磨，以从饲养细胞层中释放菌落，直到该层松动并折叠成单独的团块。用移液管吸头将饲养细胞层推到培养孔的边缘。

使用新的一毫升移液管，将悬浮菌落转移到含有饲养细胞和含有BFGF的HESC培养基的新培养皿中，以1:5的比例分裂。将培养皿转移到培养箱中，轻轻地从一侧移动到另一侧，以促进菌落的均匀分布。使用EDTA收获的HESC菌落在大小和形状上比机械收获的菌落更均匀。

对于基于EDTA的收获和机械收获，收获和重新铺板菌落中的细胞密度相似。机械收获的菌落在其中心区域有更大的坏死倾向，而使用EDTA收获的菌落表现出半透明的外观和明显的边缘。QPCR分析显示，使用机械或基于EDTA的收获20次传代后获得的菌落的mRNA处的干性标记物表达稳定。

使用机械或基于EDTA的收获在20次传代后获得的菌落，在蛋白质水平上进行免疫化学染色，也进行了类似的观察。使用任何一种方法在 20 次传代后获得的 HSC 产生的胚状体含有表达外胚层、中胚层和内胚层通常评估的标记物的细胞混合物。此外，基于QPCR的常见基因组畸变的遗传分析显示出与参考二倍体染色体模式的适度偏差。

将EDTA暴露限制在一分钟内很重要。长时间暴露会导致过多的解离。同样重要的是，将饲养层拉到一边，这样在将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞转移到新的培养皿时就不会妨碍它。

过渡到培养和EDTA通常用于病原体的无饲料条件很简单，我们对细胞的处理方式没有改变。