Dieses Protokoll bietet eine schnelle, kostengünstige Methode für die enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen, die auf Feederzellen kultiviert wurden. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es keine kostspieligen feederfreien Nährmedien und Wachstumssubstrate benötigt, das Risiko einer vollständigen Dissoziation durch Enzyme vermeidet und das Risiko verringert, dass Stammzellen in einen vorbereiteten Zustand übergehen. Das Verfahren wird von Hege Brincker Fjerdingstad, der täglichen Leiterin der norwegischen Core Facility für humane pluripotente Stammzellen, demonstriert.
Um mit dem Samen 0,5 x 10 zu beginnen, werden 6 menschliche Fibroblasten, im Folgenden als Feederzellen bezeichnet, in einem T 75-Kulturkolben mit 20 Millilitern IMDM, das 10 % FBS enthält, im Folgenden als Feederzellmedium bezeichnet, hoch aufgezogen. Wenn die Feeder-Zellen eine 90%ige Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Millilitern DPBS, um eine Hemmung von Trypsin durch Faktoren im Medium zu vermeiden. Zwei Milliliter Trypsin-EDTA in den Kolben geben und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid etwa fünf Minuten lang inkubieren, während die Ablösung der Feederzellen mit bloßem Auge beobachtet wird.
Sobald die Ablösung beginnt, beobachten Sie weiterhin die Dissoziation der Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Aggregate in einzelne Zellen dissoziiert werden. Als nächstes werden fünf Milliliter frisches, vorgewärmtes Feeder-Zellmedium in den Kolben gegeben, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren und die Feeder-Zellen vorsichtig durch Pipettieren zu suspendieren. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt, dann das Röhrchen verschlossen und 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert.
Entfernen Sie den Satat vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie es wieder in vier Milliliter frischem Feeder-Zellmedium. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Feeder-Zellen gründlich resuspendiert sind, zählen Sie sie in einer Zellzählkammer und berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Kultivierung der HSCs und HI PSCs auf 35-Millimeter-Gewebekulturschalen erforderlich sind. Als nächstes wird der mitotische Stillstand durch Gammabestrahlung durchgeführt, die entsprechende Anzahl von Feederzellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und Feeder-Zellmedium zu einem Gesamtvolumen von fünf Millilitern hinzugefügt.
Sofort bei Raumtemperatur zu einem Gammabestrahlungsgerät transportieren und bestrahlen, um die Zellen mitotisch zu arretieren. Sobald die Feederzellen unter einer Gewebekulturhaube mitotisch arretiert sind, werden die Zellen erneut in das Feeder-Zellmedium suspendiert, um eine Zellkonzentration von 1,5 x 10 zu erhalten, die auf die Potenz 5 pro Milliliter erhöht wird. Geben Sie 2 Milliliter der Feeder-Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Schale und überführen Sie die Schale in einen 37 Grad Celsius und 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.
Für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen bewegen Sie die Schale langsam, aber sicher auf der Inkubatorablage nach vorne und hinten. Halten Sie dann inne und führen Sie die gleiche Aktion von links nach rechts aus, bevor Sie die Tür des Inkubators schließen. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Feeder-Zellmedium durch IMDM mit 10%igem Serumersatz.
Aus der Kulturschale mit mitotisch arretierten Feederzellen wird 30 Minuten vor dem Transfer der Kolonien IMDM mit 10%igem Serumersatzmedium durch 1,2 Milliliter vorgewärmtes HESC-Medium mit basischem Faserblasten-Wachstumsfaktor (BFGF) ersetzt. Als nächstes wird das Medium aus einer Kulturschale mit HSCs oder HI PSCs entnommen und die Kolonien mit einem Milliliter DPBS gewaschen, um nicht anhaftende Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter 0,5 Millimolar EDTA hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius.
Ersetzen Sie dann mit einer Milliliterpipette die EDTA-Lösung durch einen Milliliter HESC-Medium, das BFGF enthält. Verreiben Sie vorsichtig mit derselben Pipette, um die Kolonien aus der Feeder-Zellschicht zu lösen, bis sich die Schicht lockert und sich in einem separaten Klumpen auf sich selbst faltet. Schieben Sie die Feeder-Zellschicht mit einer Pipettenspitze an den Rand des Kulturtopfs.
Mit einer neuen Ein-Milliliter-Pipette werden die suspendierten Kolonien in eine neue Kulturschale mit Feederzellen und BFGF-haltigem HESC-Medium überführt, wobei sie sich im Verhältnis eins zu fünf teilen. Geben Sie die Schale in einen Inkubator und bewegen Sie sie vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die gleichmäßige Verteilung der Völker zu erleichtern. Die HESC-Kolonien, die mit EDTA geerntet wurden, waren in Größe und Form homogener als die mechanisch geernteten.
Die Zelldichte in den geernteten und neu plattierten Kolonien war für die EDTA-basierte Ernte und die mechanische Ernte ähnlich. Die mechanisch geernteten Kolonien hatten eine größere Tendenz zur Entwicklung von Nekrosen in ihren zentralen Regionen, während Kolonien, die mit EDTA geerntet wurden, ein durchscheinendes Aussehen mit deutlichen Kanten aufwiesen. Die QPCR-Analyse zeigte eine stabile Expression des Stammmarkers an der mRNA für die Kolonien, die nach 20 Passagen mit mechanischer oder EDTA-basierter Ernte erhalten wurden.
Ähnliche Beobachtungen wurden mit immunchemischer Färbung auf Proteinebene für die Kolonien gemacht, die nach 20 Passagen mit mechanischer oder EDTA-basierter Ernte gewonnen wurden. Embryoidkörper, die aus den HSCs generiert wurden, die nach 20 Passagen mit einer der beiden Methoden erhalten wurden, enthielten eine Mischung von Zellen, die häufig bewertete Marker für das Ektoderm, Mesoderm und Endoderm exprimierten. Darüber hinaus zeigte die QPCR-basierte genetische Analyse häufiger genomischer Aberrationen eine moderate Abweichung von einem diploiden Referenzchromosomenmuster.
Es ist wichtig, die EDTA-Exposition auf eine Minute zu begrenzen. Eine längere Exposition kann zu einer zu starken Dissoziation führen. Es ist auch wichtig, die Feeder-Zellschicht gut zur Seite zu ziehen, damit sie beim Transfer der menschlichen embryonalen Stammzellen oder der humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in eine neue Kulturschale nicht im Weg ist.
Der Übergang zu Kultur und den futtermittelfreien Bedingungen, bei denen EDTA üblicherweise für Krankheitserreger verwendet wird, ist unkompliziert und wir ändern nichts an der Art und Weise, wie die Zellen behandelt werden.
