Este protocolo proporciona un método rápido y rentable para el paso libre de enzimas de células madre pluripotentes humanas cultivadas en células alimentadoras. La ventaja de este protocolo es que no requiere costosos medios de cultivo y sustratos de crecimiento libres de alimentadores, evita el riesgo de disociación completa por enzimas y disminuye el riesgo de que las células madre pasen a un estado cebado. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Hege Brincker Fjerdingstad, director diario de la instalación central noruega de células madre pluripotentes humanas.
Para comenzar, la semilla de 0,5 por 10 elevó a la potencia 6 fibroblastos humanos, en lo sucesivo denominados células alimentadoras, en un matraz de cultivo T 75 con 20 mililitros de IMDM que contengan un 10% de FBS, en lo sucesivo denominado medio celular alimentador. Cuando las células alimentadoras hayan alcanzado el 90% de confluencia, retire el medio y lave las células tres veces con 10 mililitros de DPBS para evitar la inhibición de la tripsina por factores en el medio. Añadir dos mililitros de tripsina EDTA al matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante unos cinco minutos, mientras se observa a simple vista el desprendimiento de las células alimentadoras.
Una vez que comience el desprendimiento, continúe observando la disociación de las células bajo un microscopio para asegurarse de que todos los agregados se disocien en células individuales. A continuación, agregue cinco mililitros de medio fresco y precalentado para la célula de alimentación al matraz para inactivar la tripsina-EDTA y suspenda suavemente las células de alimentación mediante pipeteo. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros, luego tape el tubo y centrifugue a 200 G durante 5 minutos.
Retire con cuidado el sate sin alterar el gránulo y vuelva a suspenderlo en cuatro mililitros de medio celular de alimentación fresco. Después de asegurarse de que las células alimentadoras se resuspenden completamente, cuéntelas utilizando una cámara de recuento de células y calcule el número de células necesarias para cultivar las HSC y las PSC HI en placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros. A continuación, para realizar la detención mitótica por irradiación gamma, transfiera el número adecuado de células alimentadoras a un tubo centrífugo de 50 mililitros y agregue el medio de la célula alimentadora a un volumen total de cinco mililitros.
Transportarla inmediatamente a temperatura ambiente a una máquina de irradiación gamma e irradiarla para detener las células mitóticamente. Una vez que las células alimentadoras se detienen mitóticamente bajo una campana de cultivo de tejidos, vuelva a suspender las células en el medio celular alimentador para obtener una concentración celular de 1,5 por 10 elevada a la potencia 5 por mililitro. Agregue 2 mililitros de la suspensión de la celda alimentadora a un plato de 35 milímetros y transfiera el plato a una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Para una distribución uniforme de las células, mueva la placa lenta pero firmemente en el estante de la incubadora hacia adelante y hacia atrás. A continuación, haz una pausa y realiza la misma acción de izquierda a derecha antes de cerrar la puerta de la incubadora. Después de 24 horas, reemplace el medio de la célula de alimentación con IMDM que contenga un 10% de reemplazo de suero.
A partir de la placa de cultivo que contiene células alimentadoras detenidas mitóticamente, reemplace el IMDM que contiene un medio de reemplazo de suero al 10% con 1,2 mililitros de medio HESC precalentado que contenga factor de crecimiento básico de fibroblastos o BFGF, 30 minutos antes de la transferencia de colonias. A continuación, retire el medio de una placa de cultivo que contenga HSC o HI PSC y lave las colonias con un mililitro de DPBS, para eliminar las células sueltas y los restos celulares. Añadir un mililitro de EDTA 0,5 milimolar e incubar durante un minuto a 37 grados centígrados.
Luego, con una pipeta de un mililitro, reemplace la solución de EDTA con un mililitro de medio HESC que contenga BFGF. Triture suavemente con la misma pipeta para liberar las colonias de la capa de células alimentadoras hasta que la capa se afloje y se pliegue sobre sí misma en un grupo separado. Empuje la capa de células alimentadoras hasta el borde del pozo de cultivo con una punta de pipeta.
Con una nueva pipeta de un mililitro, transfiera las colonias suspendidas a una nueva placa de cultivo con células alimentadoras y medio HESC que contenga BFGF, dividiéndolas en una proporción de uno a cinco. Transfiera el plato a una incubadora y muévalo suavemente de un lado a otro para facilitar la distribución uniforme de las colonias. Las colonias de HESC cosechadas con EDTA fueron más homogéneas en tamaño y forma que las cosechadas mecánicamente.
La densidad celular en las colonias cosechadas y replantadas fue similar para la cosecha basada en EDTA y la cosecha mecánica. Las colonias cosechadas mecánicamente tuvieron una mayor tendencia a desarrollar necrosis en sus regiones centrales, mientras que las colonias cosechadas con EDTA exhibieron una apariencia translúcida con bordes distintivos. El análisis de QPCR mostró una expresión estable del marcador de tallo en el ARNm para las colonias obtenidas después de 20 pasadas utilizando cosecha mecánica o basada en EDTA.
Se realizaron observaciones similares con tinción inmunoquímica a niveles de proteínas para las colonias obtenidas después de 20 pasadas utilizando cosecha mecánica o basada en EDTA. Los cuerpos embrioides generados a partir de las HSC obtenidas después de 20 pasadas utilizando cualquiera de los métodos contenían una mezcla de células que expresaban marcadores comúnmente evaluados para el ectodermo, el mesodermo y el endodermo. Además, el análisis genético basado en QPCR de aberraciones genómicas comunes mostró una modesta desviación de un patrón cromosómico diploide de referencia.
Es importante limitar la exposición al EDTA a un minuto. Una exposición más prolongada puede provocar demasiada disociación. También es importante separar bien la capa de células alimentadoras para que no estorbe cuando se transfieren las células madre embrionarias humanas o las células madre pluripotentes inducidas humanas a una nueva placa de cultivo.
La transición al cultivo y a las condiciones sin piensos en las que el EDTA se utiliza habitualmente para el patógeno es sencilla y no hay cambios en la forma en que se tratan las células.
