标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记

扩增显微镜的一个主要限制是聚合和消化后的荧光减慢。标签保留扩展显微镜，我们称之为LR-ExM，使用三功能锚，用于聚合和消化。使用tri函数锚点后，我们在扩展步骤后引入荧光。

因此，我们在保持良好的信噪比的同时具有高分辨率。标记保留扩展显微镜可以与任何其他先前引入的扩展显微镜以及荧光显微镜结合使用。它在通用方法中非常强大。

对于高调节成像，增强信号非常重要。首先，在16孔可拆卸的腔室盖玻片上培养细胞，在37摄氏度和5%二氧化碳下使用完整的培养基。一旦细胞计数达到约40， 000，在室温下将细胞与100微升3.2%PFA固定在PEM缓冲液中10分钟。

然后用100微升透化缓冲液在室温下透化细胞15分钟。将细胞与在细胞封闭缓冲液中稀释的链霉亲和素溶液在室温下孵育15分钟，然后用200微升细胞封闭缓冲液短暂冲洗。接下来，将细胞与在细胞封闭缓冲液中稀释的 100 微升生物素溶液在室温下孵育 15 分钟。

之后，将细胞与含有大鼠抗α微管蛋白抗体和兔抗网格蛋白重链抗体的100微升一抗溶液在4摄氏度下孵育16小时或在室温下孵育1小时。然后将细胞与含有三功能锚、驴抗兔挖MA和驴抗大鼠生物素MA的100微升二抗溶液在室温下孵育1小时。在室温下用100微升0.25%戊二醛孵育细胞15分钟，以便将蛋白质锚定在水凝胶上。

使用剃须刀片或任何选择的去除工具拆下 16 孔板的上部结构，并保持底部盖玻片。将盖玻片放入培养皿中，然后将它们放在冰上。向每个孔中加入45微升单体溶液以调节细胞。

在冰上孵育五分钟。为了制备凝胶溶液，准备一个1.5毫升的微量离心管。混合单体、双蒸水和10%T med。

不要添加每个硫酸铵。同时，将凝胶溶液管放在冰上。向凝胶溶液中加入10%过硫酸铵。

立即将40微升凝胶溶液移液到每个孔中，同时将凝胶溶液管储存在冰上。将孔板在冰上再放置三分钟。为了在37摄氏度孵育期间保持凝胶的湿度，用盖子盖住培养皿，并在培养皿中滴几滴水。

在保护样品避光的同时，将盖玻片和 10 厘米培养皿移至 37 摄氏度培养箱中 1.5 小时以进行凝胶化。凝胶化后，切开盖玻片以分离每个凝胶。将凝胶转移到六个孔板中。

向每个孔中加入两毫升消化缓冲液。将样品在室温下放置过夜或在 37 摄氏度下放置四个小时。然后用至少比最终凝胶体积多10倍的水洗涤凝胶，同时重复洗涤步骤四次，每次20至30分钟，凝胶在每个维度上膨胀约四倍。

将凝胶在两毫升体积的链霉亲和素地高辛染色缓冲液中与 2-5 微摩尔链霉亲和素染料和/或抗地高辛染料在室温下孵育 24 小时，同时将样品置于黑暗中。然后用过量的水清洗并膨胀凝胶两到四次。每次洗涤大约需要30分钟到1小时。

为了在荧光显微镜下更容易地观察细胞，请在第三次洗涤期间用DAPI对细胞进行染色。在洗涤水中稀释 DAPI 原液 1 至 5， 000 次妄想。将凝胶与DAPI溶液孵育30分钟至1小时。

然后用三毫升水再洗两次。用三毫升0.01%聚赖氨酸涂覆六孔玻璃底成像室以固定凝胶样品。然后将凝胶样品转移到编码成像室，并用任何所需的荧光范围对样品进行成像。

与蛋白质保留扩展显微镜或生物素扩展显微镜样品相比，标记保留扩展显微镜显示增强的荧光标记。与蛋白质保留扩展显微镜相比，标记保留扩展显微镜显示的荧光信号高出约六倍。LR-ExM可以有效地捕获小结构，例如具有亚折射极限分辨率的网格蛋白涂层凹坑。

微管和网格蛋白包被的凹坑是使用功能锚，NHS MA挖掘和NHS MA生物素的共免疫染色。类似地，网格蛋白包被的凹坑和线粒体使用具有三功能锚的酶蛋白标签方法进行标记，例如BG MA生物素和BC MA挖掘。此外，结合免疫染色法和酶蛋白标签法，揭示了层粘连蛋白A/C和核苷孔复合物的结构。

通过对突触前标记物巴松管和突触后标记物Homer 1进行共免疫染色，对小鼠脑组织进行标记保留扩展显微镜检查。两个标签清晰且分离良好，支持高分辨率和标记效率。劳动力保留扩展显微镜是一种通用且强大的方法，可以与以前引入的任何其他扩展显微镜结合使用。

对于高分辨率成像，实现良好的标记效率以更好地捕获分子尺度结构非常重要。劳动保留扩展显微镜是增强信号的有效且稳健的方法。