팽창 현미경의 주요 한계 중 하나는 중합 및 분해 후 형광이 느려진다는 것입니다. LR-ExM이라고 부르는 라벨 머무름 확장 현미경은 중합 및 분해를 위한 삼중 기능 앵커를 사용합니다. 트라이 기능 앵커를 사용한 후, 팽창 단계 후에 형광을 도입합니다.
그래서 우리는 높은 해상도를 가지면서 좋은 신호 대 잡음비를 유지합니다. 라벨 머무름 확장 현미경은 이전에 도입된 다른 확장 현미경 및 형광 현미경과 결합할 수 있습니다. 다양한 방법으로 매우 견고합니다.
그리고 높은 규제 이미징을 위해서는 향상된 신호를 갖는 것이 정말 중요합니다. 시작하려면 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 완전한 배지가있는 16 웰 탈착식 챔버 커버 유리에서 세포를 배양합니다. 세포 수가 약 40, 000에 도달하면 실온에서 10 분 동안 PEM 버퍼에 100 마이크로 리터의 3.2 % PFA로 세포를 고정시킵니다.
그 후 실온에서 100 마이크로리터의 투과 완충액으로 세포를 15분 동안 투과화시킨다. 세포 차단 완충액에 희석된 스트렙타비딘 용액으로 세포를 실온에서 15분 동안 배양한 다음, 200마이크로리터의 세포 차단 완충액으로 간단히 헹구었다. 다음으로, 세포 차단 완충액에 희석된 100 마이크로리터의 비오틴 용액으로 세포를 실온에서 15분 동안 배양한다.
그 후, 래트 항 알파 튜불린 항체 및 토끼 항 클라트린 중쇄 항체를 함유하는 100 마이크로리터의 1차 항체 용액으로 세포를 섭씨 4도에서 16시간 또는 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서 세포를 실온에서 1시간 동안 삼작용성 앵커, 당나귀 항 토끼 디그마, 및 당나귀 항 래트 비오틴 MA를 함유하는 100 마이크로리터의 2차 항체 용액과 함께 인큐베이션한다. 단백질을 하이드로겔 상에 고정시키기 위해 실온에서 15분 동안 100마이크로리터의 0.25%글루타르알데히드로 세포를 배양한다.
면도날 또는 선택한 제거 도구로 16웰 플레이트의 상부 구조를 제거하고 하단 덮개 유리를 유지합니다. 커버 유리를 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 각 웰에 45마이크로리터의 단량체 용액을 추가하여 세포를 컨디셔닝합니다.
얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오. 겔화 용액을 만들려면 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브를 준비하십시오. 단량체, 이중 증류수 및 10%T med를 혼합합니다.
아직 황산염 당 암모늄을 첨가하지 마십시오. 한편, 겔화 용액 튜브를 얼음 위에 두십시오. 겔화 용액에 10 % 과황산 암모늄을 첨가하십시오.
즉시 40 마이크로리터의 겔화 용액을 각 웰에 피펫팅하고 겔화 용액 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 웰 플레이트를 얼음 위에 3 분 더 놓습니다. 섭씨 37도 배양 중에 젤의 습도를 유지하려면 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 페트리 접시에 몇 방울의 물을 넣으십시오.
샘플을 빛으로부터 보호하면서 커버 유리와 10cm 페트리 접시를 섭씨 37도 인큐베이터로 1.5 시간 동안 옮겨 겔화시킵니다. 겔화 후, 커버 유리를 절단하여 각 겔을 분리한다. 젤을 6 웰 플레이트로 옮깁니다.
각 웰에 2 밀리리터의 소화 완충액을 첨가하십시오. 샘플을 실온에서 밤새 또는 섭씨 37도에서 4 시간 동안 그대로 두십시오. 이어서 매번 20 내지 30분 동안 세척 단계를 4회 반복하면서 최종 겔 부피보다 적어도 10배 과량의 물로 겔을 세척하고, 겔은 각 차원에서 약 4배씩 팽창한다.
샘플을 어두운 곳에 유지하면서 실온에서 24시간 동안 2-5개의 마이크로몰 스트렙타비딘 염료 및/또는 안티 디곡시게닌 염료와 함께 2밀리리터 부피의 스트렙타비딘 디곡시제닌 염색 완충액에 겔을 배양합니다. 그런 다음 과도한 물로 젤을 2-4 회 씻고 확장하십시오. 각 세척에는 약 30 분에서 1 시간이 걸립니다.
형광 현미경으로 세포를 더 쉽게 시각화하려면 세 번째 세척 중에 DAPI로 세포를 염색하십시오. 세척수에 1에서 5, 000 망상에 DAPI 재고를 희석하십시오. 겔을 DAPI 용액과 함께 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 3 밀리리터의 물로 2 회 더 씻으십시오. 6웰 유리 바닥 이미징 챔버를 3밀리리터의 0.01%폴리라이신으로 코팅하여 겔 샘플을 고정화합니다. 그런 다음 겔 샘플을 코딩된 이미징 챔버로 옮기고 원하는 형광 스코프를 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
라벨 머무름 확장 현미경은 단백질 머무름 확장 현미경 또는 비오틴 확장 현미경 샘플에 비해 향상된 형광 라벨링을 보여줍니다. 라벨 머무름 확장 현미경은 단백질 머무름 확장 현미경에 비해 약 6배 더 높은 형광 신호를 보여줍니다. LR-ExM은 하위 굴절 한계 분해능을 가진 클라 트린 코팅 피트와 같은 작은 구조를 효과적으로 캡처 할 수 있습니다.
미세소관 및 클라트린 코팅 피트는 기능성 앵커, NHS MA 발굴, 및 NHS MA 비오틴을 사용하여 공동-면역염색하였다. 유사하게, 클라트린 코팅 피트 및 미토콘드리아는 BG MA 비오틴 및 BC MA 발굴과 같은 삼중 기능성 앵커를 갖는 효소 단백질 태그 접근법을 사용하여 표지되었다. 또한 면역 염색 기반 접근법과 효소 단백질 태그 접근법을 결합하여 라민 A / C 및 뉴 클레오 기공 복합체의 구조를 보여줍니다.
표지 보유 확장 현미경은 시냅스 전 마커인 바순과 시냅스 후 마커인 호머 1을 공동면역 염색하여 마우스 뇌 조직에 대해 수행하였다. 두 라벨은 명확하고 잘 분리되어 고해상도 및 라벨링 효율성을 지원합니다. 노동 유지 확장 현미경은 이전에 도입된 다른 확장 현미경과 결합할 수 있는 다재다능하고 강력한 방법입니다.
고해상도 이미징의 경우 분자 스케일 구조를 더 잘 포착하기 위해 우수한 라벨링 효율을 달성하는 것이 중요합니다. 노동 유지 확장 현미경은 신호를 향상시키는 효과적이고 강력한 방법입니다.
