أحد القيود الرئيسية على الفحص المجهري التوسعي هو أن التألق يتباطأ بعد البلمرة والهضم. يستخدم المجهر المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات ، والذي نسميه LR-ExM ، مراسي ثلاثية الوظائف ، والتي هي من أجل البلمرة والهضم. بعد أن نستخدم مرساة ثلاثية الوظائف ، نقدم التألق بعد خطوة التوسع.
لذلك نحافظ على نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء مع وجود دقة عالية. يمكن دمج المجهر المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات مع أي مجهر توسع آخر تم تقديمه مسبقا ، وكذلك المجهر الفلورسنت. إنه قوي جدا بطريقة متعددة الاستخدامات.
وبالنسبة للتصوير عالي التنظيم ، من المهم حقا الحصول على إشارة محسنة. للبدء ، تقوم خلايا الاستزراع على 16 زجاجا قابلا للإزالة بشكل جيد بتغطية زجاجية مع وسط كامل عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن يصل عدد الخلايا إلى حوالي 40،000 ، قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 100 ميكرولتر من 3.2٪ PFA في مخزن PEM المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم تخلل الخلايا مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت permeablization في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. احتضن الخلايا بمحلول الستربتافيدين المخفف في مخزن مؤقت لحجب الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اشطفها لفترة وجيزة باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخلايا. بعد ذلك ، احتضن الخلايا التي تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول البيوتين المخفف في مخزن مؤقت لحجب الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، احتضن الخلايا التي تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على الجسم المضاد للفئران ألفا توبولين والأجسام المضادة للسلسلة الثقيلة المضادة للأرنب المضاد للكلاثرين لمدة 16 ساعة عند أربع درجات مئوية أو ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضن الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على مراسي ثلاثية الوظائف ، والحمار المضاد للأرانب حفر MA ، والحمار البيوتين المضاد للفئران MA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من 0.25 ٪ Glutaraldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل تثبيت البروتينات على هيدروجيل.
قم بإزالة الهيكل العلوي للوحة البئر 16 باستخدام شفرة الحلاقة أو أي أداة إزالة من اختيارك واحتفظ بزجاج الغطاء السفلي. ضع كوب الغطاء في طبق بتري وضعه على الثلج. أضف 45 ميكرولتر محلول مونومر إلى كل بئر لتكييف الخلايا.
احتضن على الجليد لمدة خمس دقائق. لصنع محلول التبلور ، قم بإعداد أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. مزيج مونومر ، ماء مقطر مزدوج ، و 10٪ T med.
لا تضيف الأمونيوم لكل كبريتات حتى الآن. وفي الوقت نفسه ، احتفظ بأنبوب محلول الهلام على الجليد. أضف 10٪ من بيرسلفات الأمونيوم إلى محلول الهلام.
قم على الفور بماصة 40 ميكرولتر من محلول الهلام على كل بئر أثناء تخزين أنبوب محلول الهلام على الجليد. ضع طبق البئر على الجليد لمدة ثلاث دقائق أخرى. للحفاظ على رطوبة الجل أثناء حضانة 37 درجة مئوية ، قم بتغطية طبق بتري بالغطاء ووضع بضع قطرات من الماء في طبق بتري.
أثناء حماية العينة من الضوء ، حرك زجاج الغطاء وطبق بتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للتبلور. بعد التبلور ، اقطع زجاج الغطاء لفصل كل هلام. انقل المواد الهلامية إلى ستة ألواح بئر.
أضف ملليلترين من مخزن الهضم المؤقت إلى كل بئر. اترك العينات إما بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل المواد الهلامية التي تحتوي على ما لا يقل عن 10 أضعاف حجم الماء الزائد من حجم الجل النهائي مع تكرار خطوة الغسيل أربع مرات لمدة 20 إلى 30 دقيقة في كل مرة ، ويتوسع الجل بحوالي أربعة أضعاف في كل بعد.
احتضان المواد الهلامية في حجم ملليلتر من المخزن المؤقت لتلطيخ الستربتافيدين ديجوكسيجينين مع اثنين إلى خمسة صبغة ستربتافيدين ميكرومولار و / أو صبغة ديجوكسيجينين مضادة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على العينات في الظلام. ثم اغسل الجل ووسعه مرتين إلى أربع مرات بالماء الزائد. يستغرق كل غسل حوالي 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
لتسهيل تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI أثناء الغسيل الثالث. تمييع مخزون DAPI في واحد إلى 5،000 وهم في مياه الغسيل. احتضن الجل بمحلول DAPI لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
ثم اغسل مرتين إضافيتين بثلاثة ملليلتر من الماء. قم بتغطية غرفة التصوير ذات القاع الزجاجي الستة بثلاثة ملليلترات من البوليليسين بنسبة 0.01٪ لشل حركة عينات الجل. ثم انقل عينات الجل إلى غرفة التصوير المشفرة وصور العينات بأي نطاقات فلورية مطلوبة.
يظهر الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات وضع علامات مضيئة محسنة مقارنة بمجهر توسيع الاحتفاظ بالبروتين أو عينات مجهر توسع البيوتين. يظهر مجهر توسيع الاحتفاظ بالملصقات إشارة تألق أعلى بحوالي ستة أضعاف مقارنة بمجهر توسيع الاحتفاظ بالبروتين. يمكن ل LR-ExM التقاط الهياكل الصغيرة بشكل فعال ، مثل الحفر المطلية بالكلاثرين بدقة حد الانحراف.
كانت الأنابيب الدقيقة والحفر المطلية بالكلاثرين عبارة عن بقع مناعية مشتركة باستخدام المراسي الوظيفية ، وحفر NHS MA ، و NHS MA biotin. وبالمثل ، تم تصنيف الحفر المطلية بالكلاثرين والميتوكوندريا باستخدام نهج علامة البروتين الأنزيمي مع المراسي الثلاثية الوظائف ، مثل BG MA biotin و BC MA dig. علاوة على ذلك ، يتم الجمع بين النهج القائم على التلطيخ المناعي ونهج علامة البروتين الأنزيمي لإظهار بنية مكيف اللامين ومجمع النيوكليوبور.
تم إجراء الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالتسمية على أنسجة دماغ الفأر عن طريق تلطيخ المناعة المشتركة لعلامة ما قبل المشبكي ، باسون ، وعلامة ما بعد المشبكي ، هوميروس 1. كانت العلامتان واضحتين ومنفصلتين بشكل جيد ، مما يدعم الدقة العالية وكفاءة وضع العلامات. يعد الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالعمالة طريقة متعددة الاستخدامات وقوية ، والتي يمكن دمجها مع أي مجهر توسع آخر تم تقديمه مسبقا.
بالنسبة للتصوير عالي الدقة ، من المهم تحقيق كفاءة جيدة في وضع العلامات لالتقاط بنية المقياس الجزيئي بشكل أفضل. المجهر توسيع الاحتفاظ بالعمالة هو وسيلة فعالة وقوية لتعزيز الإشارة.
