Eine wesentliche Einschränkung der Expansionsmikroskopie ist die Verlangsamung der Fluoreszenz nach Polymerisation und Aufschluss. Die Expansionsmikroskopie der Etikettenretention, wir nennen sie LR-ExM, verwendet trifunktionale Anker, die zur Polymerisation und zum Aufschluss dienen. Nachdem wir Trifunktionsanker verwendet haben, führen wir nach dem Expansionsschritt Fluoreszenz ein.
So behalten wir ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis bei gleichzeitig hoher Auflösung bei. Die Expansionsmikroskopie zur Markierungsretention kann mit jeder anderen zuvor eingeführten Expansionsmikroskopie und auch mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert werden. Es ist sehr robust in vielseitiger Methode.
Und für die Bildgebung mit hoher Regulierung ist es wirklich wichtig, ein verbessertes Signal zu haben. Zu Beginn kultivieren Zellen auf einem 16 gut abnehmbaren Kammerdeckglas mit komplettem Medium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Sobald die Zellzahl etwa 40.000 erreicht, fixieren Sie Zellen mit 100 Mikrolitern 3,2% PFA im PEM-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann permeabilisieren Sie Zellen mit dem 100 Mikroliter Permeablisierungspuffer bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Zellen mit der in einem Zellblockierpuffer verdünnten Streptavidinlösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann kurz mit 200 Mikrolitern Zellblockierpuffer abspülen. Als nächstes inkubieren Sie Zellen mit 100 Mikrolitern Biotinlösung, verdünnt in einem Zellblockierpuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Danach inkubieren Zellen mit 100 Mikrolitern primärer Antikörperlösung, die Ratten-Anti-Alpha-Tubulin-Antikörper und Kaninchen-Anti-Clathrin-Schwerkettenantikörper enthält, entweder 16 Stunden bei vier Grad Celsius oder eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie Zellen mit 100 Mikrolitern sekundärer Antikörperlösung, die trifunktionelle Anker enthält, Esel Anti-Kaninchen-Grabung MA und Esel Anti-Ratten-Biotin MA für eine Stunde bei Raumtemperatur. Zellen mit 100 Mikrolitern 0,25% Glutaraldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Proteine auf dem Hydrogel zu verankern.
Entfernen Sie die obere Struktur der 16-Well-Platte mit der Rasierklinge oder einem beliebigen Entnahmewerkzeug Ihrer Wahl und behalten Sie das untere Deckglas. Stellen Sie das Deckglas in eine Petrischale und legen Sie es auf Eis. Fügen Sie 45 Mikroliter eine Monomerlösung zu jeder Vertiefung hinzu, um die Zellen zu konditionieren.
Fünf Minuten auf Eis brüten. Um die Gelierungslösung herzustellen, bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Monomer, doppelt destilliertes Wasser und 10% T med.
Fügen Sie das Ammonium noch nicht pro Sulfat hinzu. In der Zwischenzeit das Gelationslösungsröhrchen auf dem Eis halten. 10% Ammoniumpersulfat in die Gelierlösung geben.
Pipettieren Sie sofort 40 Mikroliter Gelierlösung auf jede Vertiefung, während Sie ein Gelierlösungsröhrchen auf Eis lagern. Stellen Sie die Brunnenplatte für weitere drei Minuten auf Eis. Um die Feuchtigkeit des Gels während der 37 Grad Celsius Inkubation zu halten, decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und geben Sie ein paar Tropfen Wasser in die Petrischale.
Während Sie die Probe vor Licht schützen, bewegen Sie das Deckglas und die 10 Zentimeter große Petrischale für 1,5 Stunden zur Gelierung in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Schneiden Sie nach der Gelierung das Deckglas, um jedes Gel zu trennen. Übertragen Sie Gele auf sechs Well-Platten.
Fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Verdauungspuffer hinzu. Lassen Sie die Proben entweder über Nacht bei Raumtemperatur oder vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann waschen Sie Gele mit mindestens 10-fachem überschüssigem Wasservolumen als das endgültige Gelvolumen, während Sie den Waschschritt viermal für jeweils 20 bis 30 Minuten wiederholen, und das Gel dehnt sich in jeder Dimension um etwa das Vierfache aus.
Inkubieren Sie Gele in zwei Milliliter Volumen Streptavidin-Digoxigenin-Färbepuffer mit zwei bis fünf Mikromolaren Streptavidinfarbstoff und/oder Anti-Digoxigenin-Farbstoff für 24 Stunden bei Raumtemperatur, während die Proben im Dunkeln gehalten werden. Dann waschen und expandieren Sie das Gel zwei- bis viermal mit überschüssigem Wasser. Jede Wäsche dauert etwa 30 Minuten bis eine Stunde.
Zur leichteren Visualisierung von Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie die Zellen während der dritten Wäsche mit DAPI färben. Verdünnen Sie DAPI-Brühe in einem bis 5.000 Wahnvorstellungen in Waschwasser. Inkubieren Sie das Gel mit einer DAPI-Lösung für 30 Minuten bis eine Stunde.
Anschließend zwei weitere Male mit drei Milliliter Wasser waschen. Beschichten Sie die sechs Glasboden-Bildgebungskammern mit drei Milliliter 0,01% Polylysin, um die Gelproben zu immobilisieren. Dann werden Gelproben in die codierte Bildgebungskammer überführt und die Proben mit den gewünschten Fluoreszenzbereichen abgebildet.
Die Expansionsmikroskopie der Markierung zeigt eine verbesserte Fluoreszenzmarkierung im Vergleich zur Proteinretentionsexpansionsmikroskopie oder Biotinexpansionsmikroskopie. Die Expansionsmikroskopie der Markierungsretention zeigt ein etwa sechsmal höheres Fluoreszenzsignal im Vergleich zur Proteinretentionsexpansionsmikroskopie. LR-ExM kann kleine Strukturen wie Clathrin-beschichtete Gruben mit Subdefraktionsgrenzauflösung effektiv erfassen.
Mikrotubuli und Clathrin-beschichtete Gruben waren Co-Immunfärbungen mit funktionellen Ankern, NHS MA dig und NHS MA Biotin. In ähnlicher Weise wurden Clathrin-beschichtete Gruben und Mitochondrien mit einem enzymatischen Protein-Tag-Ansatz mit trifunktionalen Ankern wie BG MA-Biotin und BC MA-Grabung markiert. Darüber hinaus werden der auf Immunfärbung basierende Ansatz und der enzymatische Protein-Tag-Ansatz kombiniert, um die Struktur von Lamin A / C und Nukleopor-Komplex zu zeigen.
Die Expansionsmikroskopie der Markierungsretention wurde am Hirngewebe der Maus durch Co-Immunfärbung des präsynaptischen Markers Fagott und des postsynaptischen Markers Homer 1 durchgeführt. Die beiden Etiketten waren klar und gut getrennt, was eine hohe Auflösung und Etikettiereffizienz unterstützt. Die Expansionsmikroskopie ist eine vielseitige und robuste Methode, die mit jeder anderen zuvor eingeführten Expansionsmikroskopie kombiniert werden kann.
Für hochauflösende Bildgebung ist es wichtig, eine gute Markierungseffizienz zu erreichen, um die molekulare Struktur besser zu erfassen. Die Mikroskopie zur Ausdehnung der Arbeitsretention ist eine effektive und robuste Methode zur Verstärkung des Signals.
