מגבלה מרכזית אחת של מיקרוסקופיית התפשטות היא האטות פלואורסצנטיות לאחר פילמור ועיכול. מיקרוסקופיית הרחבת שמירת תוויות, אנו קוראים לה LR-ExM, משתמשת בשלושה עוגנים פונקציונליים, אשר נועדו לפילמור ועיכול. לאחר שאנו משתמשים בעוגן של שלוש פונקציות, אנו מציגים פלואורסצנציה לאחר שלב ההתרחבות.
אז אנחנו שומרים על יחס אות טוב לרעש תוך כדי רזולוציה גבוהה. מיקרוסקופיית הרחבת שמירת תוויות יכולה להיות משולבת עם כל מיקרוסקופיית הרחבה אחרת שהוצגה בעבר, וגם מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות. הוא חזק מאוד בשיטה רב-תכליתית.
ולגבי הדמיה בוויסות גבוה, חשוב מאוד לקבל אות משופר. כדי להתחיל, תאי תרבית על 16 זכוכית כיסוי תא נשלפת היטב עם מדיום שלם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר ספירת התאים להגיע כ 40, 000, לתקן תאים עם 100 microliters של 3.2% PFA במאגר PEM במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן חלחלו לתאים עם 100 מיקרוליטרים של חיץ פרמבליזציה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לדגום תאים עם תמיסת סטרפטאבידין מדוללת במאגר חוסם תאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף לזמן קצר עם 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם תאים. לאחר מכן, דגירה של תאים עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת ביוטין מדוללת במאגר חוסם תאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, דגירה של תאים עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית המכילה נוגדן נגד אלפא טובולין של חולדה ונוגדן שרשרת כבדה נגד קלתרין למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס או שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגירה של תאים עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית המכילה עוגנים תלת-תפקודיים, חמור נגד ארנבת חופרת MA, וחמור אנטי חולדה ביוטין MA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לדגור תאים עם 100 מיקרוליטר של 0.25% גלוטרלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לעגן את החלבונים על הידרוג'ל.
הסר את המבנה העליון של לוח 16 הבאר עם סכין הגילוח או כל כלי הסרה לבחירה ושמור על זכוכית הכיסוי התחתונה. מניחים את הכיסוי בצלחת פטרי ומניחים אותם על קרח. הוסף 45 מיקרוליטר תמיסת מונומר לכל באר כדי לרכך תאים.
לדגור על הקרח במשך חמש דקות. כדי להפוך את פתרון gelation, להכין צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. מערבבים מונומר, מים מזוקקים כפולים ו-10% T med.
אין להוסיף את האמוניום לסולפט עדיין. בינתיים, שמור את צינור תמיסת ג'לציה על הקרח. יש להוסיף 10% אמוניום פרסולפט לתמיסת הג'לציה.
מיד פיפטה 40 מיקרוליטר של תמיסת ג'לציה על כל באר תוך אחסון צינור תמיסת ג'לציה על קרח. מניחים את צלחת הבאר על הקרח לשלוש דקות נוספות. כדי לשמור על לחות הג'ל במהלך הדגירה של 37 מעלות צלזיוס, כיסה את צלחת פטרי עם המכסה והכניס כמה טיפות מים לצלחת פטרי.
תוך כדי הגנה על הדגימה מפני אור, הזיזו את זכוכית הכיסוי ואת צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לג'לציה. לאחר הג'לציה, חותכים את הכיסוי כדי להפריד כל ג'ל. מעבירים את הג'לים לשש צלחות באר.
מוסיפים שני מיליליטר של חיץ עיכול לכל באר. השאירו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורת החדר או למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לכבס ג'לים עם נפח מים עודף של פי 10 לפחות מנפח הג'ל הסופי תוך חזרה על שלב הכביסה ארבע פעמים במשך 20 עד 30 דקות בכל פעם, והג'ל מתרחב בכארבעה פעמים בכל ממד.
דגירה של ג'לים בנפח של שני מיליליטר של סטרפטווידין דיגוקסיגנין מכתים חיץ עם שניים עד חמישה מיקרומולרים של צבע סטרפטווידין ו/או צבע אנטי דיגוקסיגנין למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר תוך שמירה על הדגימות בחושך. לאחר מכן לשטוף ולהרחיב את הג'ל פעמיים עד ארבע פעמים עם מים מוגזמים. כל כביסה אורכת כ-30 דקות עד שעה.
להדמיה קלה יותר של תאים תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, יש להכתים תאים עם DAPI במהלך השטיפה השלישית. לדלל מלאי DAPI באחד עד 5, 000 הזיות במי שטיפה. לדגור את הג'ל עם תמיסת DAPI במשך 30 דקות עד שעה.
לאחר מכן לשטוף פעמיים נוספות עם שלושה מיליליטר מים. מצפים את ששת תאי ההדמיה התחתונים מזכוכית עם שלושה מיליליטר של 0.01% פוליליזין כדי לשתק את דגימות הג'ל. לאחר מכן העבירו דגימות ג'ל לתא ההדמיה המקודד ודמיינו את הדגימות עם כל טווחי הפלואורסצנציה הרצויים.
מיקרוסקופיית הרחבת שמירת תוויות מראה תיוג פלואורסצנטי משופר בהשוואה למיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים או דגימות מיקרוסקופיה של הרחבת ביוטין. מיקרוסקופיית הרחבת שמירת תוויות מראה אות פלואורסצנטי גבוה פי שישה בערך בהשוואה למיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים. LR-ExM יכול ללכוד ביעילות מבנים קטנים, כגון בורות מצופים קלתרין ברזולוציית גבול תת-קרקעית.
מיקרוטובולים ובורות מצופים קלתרין היו כתמי קו-אימונו באמצעות עוגנים פונקציונליים, חפירת NHS MA וביוטין NHS MA. באופן דומה, בורות מצופים קלתרין ומיטוכונדריה סומנו בגישת תג חלבון אנזימטית עם עוגנים תלת-תפקודיים, כגון ביוטין BG MA וחפירת BC MA. יתר על כן, גישה מבוססת צביעה חיסונית וגישת תג החלבון האנזימטי משולבות כדי להראות את המבנה של מיזוג אוויר לאמין וקומפלקס נוקלאופורים.
מיקרוסקופיית הרחבת שמירת התוויות בוצעה על רקמת המוח של העכבר על ידי קו-אימונו שהכתים את הסמן הקדם-סינפטי, בסון, ואת הסמן הפוסט-סינפטי, הומרוס 1. שתי התוויות היו ברורות ומופרדות היטב, מה שתומך ביעילות של רזולוציה גבוהה ותיוג. מיקרוסקופיה להרחבת שימור עובדים היא שיטה רב-תכליתית וחזקה, שניתן לשלב אותה עם כל מיקרוסקופיית הרחבה אחרת שהוצגה בעבר.
עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה, חשוב להשיג יעילות תיוג טובה כדי ללכוד טוב יותר את מבנה קנה המידה המולקולרי. מיקרוסקופיה להרחבת שימור העבודה היא שיטה יעילה וחזקה לשיפור האות.
