Одним из основных ограничений расширительной микроскопии является замедление флуоресценции после полимеризации и пищеварения. Расширительная микроскопия удержания этикеток, мы называем ее LR-ExM, использует три функциональных якоря, которые предназначены для полимеризации и пищеварения. После того, как мы используем трехфункциональный анкер, мы вводим флуоресценцию после шага расширения.
Таким образом, мы сохраняем хорошее соотношение сигнал/шум при высоком разрешении. Расширительная микроскопия удержания этикеток может сочетаться с любыми другими ранее введенными расширительными микроскопиями, а также флуоресцентными микроскопиями. Он очень надежен в универсальном методе.
А для визуализации с высоким регулированием очень важно иметь усиленный сигнал. Для начала культивируемые клетки на 16 хорошо съемных камерах покрывают стекло с полной средой при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Как только количество клеток достигнет приблизительно 40 000, зафиксируйте клетки 100 микролитрами 3,2% PFA в буфере PEM в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем пермеабилизируйте клетки 100 микролитрами буфера пермеаблизации при комнатной температуре в течение 15 минут. Инкубировать клетки раствором стрептавидина, разбавленным в клеточном блокирующем буфере в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем ненадолго промыть 200 микролитрами клеточного блокирующего буфера. Далее инкубируют клетки со 100 микролитрами раствора биотина, разбавленного в клеточном блокирующем буфере в течение 15 минут при комнатной температуре.
После этого инкубируют клетки со 100 микролитрами раствора первичного антитела, содержащего антитело против альфа-тубулина крыс и антитело против клатрина кролика с тяжелой цепью, в течение 16 часов при четырех градусах Цельсия или одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируют клетки со 100 микролитрами раствора вторичных антител, содержащих трифункциональные якоря, ослиный анти-кролик dig MA и ослиный анти-крысиный биотин MA в течение одного часа при комнатной температуре. Инкубируйте клетки со 100 микролитрами 0,25% глутаральдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы закрепить белки на гидрогеле.
Снимите верхнюю структуру пластины 16 лунок лезвием бритвы или любым инструментом для удаления по выбору и сохраните стекло нижней крышки. Поместите покровное стекло в чашку Петри и положите его на лед. Добавьте 45 микролитров раствора мономера в каждую лунку для кондиции клеток.
Инкубировать на льду в течение пяти минут. Для приготовления раствора для гелеобразования приготовьте микроцентрифужную трубку объемом 1,5 миллилитра. Смешайте мономер, двойную дистиллированную воду и 10% T med.
Пока не добавляйте аммоний на сульфат. Тем временем держите тюбик с гелевым раствором на льду. Добавьте 10% персульфат аммония в гелеобразный раствор.
Сразу же пипетку 40 микролитров раствора для гелеобразования на каждую лунку при хранении на льду трубки с гелевым раствором. Поместите плиту колодца на лед еще на три минуты. Чтобы сохранить влажность геля во время инкубации 37 градусов Цельсия, накройте чашку Петри крышкой и положите несколько капель воды в чашку Петри.
Защищая образец от света, переместите покровное стекло и 10-сантиметровую чашку Петри в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов для гелеобразования. После гелеобразования разрежьте покровный стакан, чтобы отделить каждый гель. Переложите гели на шесть луночных пластин.
Добавьте два миллилитра буфера пищеварения в каждую лунку. Оставьте образцы либо на ночь при комнатной температуре, либо на четыре часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем промывайте гели по меньшей мере 10-кратным избыточным объемом воды, чем конечный объем геля, повторяя этап умывания четыре раза в течение 20-30 минут каждый раз, и гель расширяется примерно в четыре раза в каждом измерении.
Инкубировать гели в двух миллилитрах объема буфера окрашивания стрептавидин дигоксигенин с двумя-пятью микромолярными красителями стрептавидина и/или антидигоксигениновым красителем в течение 24 часов при комнатной температуре, сохраняя образцы в темноте. Затем вымойте и разверните гель в два-четыре раза, обильно запивая водой. Каждая стирка занимает от 30 минут до одного часа.
Для облегчения визуализации клеток под флуоресцентной микроскопией окрашивают клетки с помощью DAPI во время третьей промывки. Разбавьте запас DAPI от одного до 5000 бредов в промывочной воде. Инкубировать гель с раствором DAPI в течение от 30 минут до одного часа.
Затем два дополнительных раза промыть тремя миллилитрами воды. Покройте камеру визуализации со стеклянным дном из шести скважин тремя миллилитрами 0,01% полилизина, чтобы обездвижить образцы геля. Затем перенесите образцы геля в закодированную камеру визуализации и визуализируйте образцы с любыми желаемыми флуоресцентными областями.
Микроскопия расширения удержания меток показывает улучшенную флуоресцентную маркировку по сравнению с микроскопией расширения удержания белка или образцами микроскопии расширения биотина. Микроскопия расширения удержания меток показывает примерно в шесть раз более высокий флуоресцентный сигнал по сравнению с микроскопией расширения удержания белка. LR-ExM может эффективно захватывать небольшие структуры, такие как ямы с клатриновым покрытием, с разрешением пределов субдефракции.
Микротрубочки и ямы, покрытые клатрином, были коиммуно-иммунономинными пятнами с использованием функциональных анкеров, NHS MA dig и NHS MA biotin. Аналогичным образом, покрытые клатрином ямки и митохондрии были помечены с использованием ферментативной белковой метки с тремя функциональными якорями, такими как биотин BG MA и BC MA dig. Кроме того, подход, основанный на иммунокраслении, и подход ферментативной белковой метки объединены, чтобы показать структуру ламина A / C и нуклеопорного комплекса.
Микроскопия расширения удержания меток была выполнена на ткани мозга мыши путем коиммуно окрашивания пресинаптического маркера, фагота и постсинаптического маркера Гомера 1. Эти две метки были четкими и хорошо разделенными, что поддерживает высокое разрешение и эффективность маркировки. Расширительная микроскопия удержания труда является универсальным и надежным методом, который можно комбинировать с любыми другими ранее введенными микроскопиями расширения.
Для визуализации с высоким разрешением важно достичь хорошей эффективности маркировки, чтобы лучше захватывать структуру молекулярного масштаба. Расширительная микроскопия удержания труда является эффективным и надежным методом усиления сигнала.
