使用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝硬度

我们的协议提供了肝脏部分富含胶原蛋白和缺乏胶原蛋白的区域之间的区别。因此，它可以用来更详细地研究纤维化的过程。该技术的主要优点在于使用偏振显微镜来定位肝脏切片中富含胶原蛋白的区域。

我们的方案可以为肝纤维化的发展提供深刻的见解，并且在某些优化后也可以用于其他软组织，例如肺。首先，从零下80摄氏度下取出冷冻的肝脏切片，并在室温下解冻两分钟。在 PBS 中用冰冷的 4% 多聚甲醛固定切片 10 分钟，在 4 摄氏度下，然后用 PBS 洗涤五次。

最后一次洗涤后，用纸巾擦拭肝切片周围多余的PBS，并用疏水记号笔在肝切片周围标记约两乘四厘米的边界。用PBS覆盖样品，然后将样品加载到AFM载物台上，并用AFM头覆盖。在原子力显微镜或AFM软件中，转到设置选项卡并在自动保存时标记勾号以自动保存所有文件。

然后，通过转到设置选项卡并单击保存设置来指定用于保存测量文件的文件名和目录。通过打开激光并单击接近键，使用 AFM 悬臂接近组织表面。接近完成后，通过单击缩回键一次缩回悬臂尖端，这会将悬臂缩回压电范围的顶端。

如果需要，使用AFM头上的旋钮重新对齐探测器。关闭激光。提示现在是目标的焦点。

接下来，通过单击附件选项卡并选择直接叠加光学校准，将显微镜的光学场与AFM测量图叠加。在随后的窗口中，单击下一步以拍摄悬臂扫描特定区域的一系列图像。再次单击下一步转到下一个窗口。

在第一个图像中，手动单击悬臂尖端的中心以描绘软件中的尖端位置。描述尖端位置的圆可以通过指示其半径来操纵其大小以提高精度。单击校准以自动检测所有图像中的悬臂尖端位置。

通过浏览图像确认尖端检测的准确性。单击"下一步"，然后单击"完成"以完成光学覆盖。接下来，使用偏振图像移动载物台以将富含胶原蛋白的区域放置在绿色框中，在数据查看器选项卡中可见。

通过在网格选项卡下定义区域来选择富含胶原蛋白的区域，然后在指定的绿色框中长按鼠标左键在数据查看器选项卡上创建一个矩形。单击确认新扫描区域，将所选区域设置为测量区域。设置反馈循环的参数。

将 I 增益设置为 50 赫兹，将 P 增益设置为 0.001。然后将设定点设置为一纳米牛顿。根据所研究材料的机械性能和悬臂刚度选择相对设定点值。

指定刚好基线以正确拟合力曲线。然后根据样品的表面形貌在Z轴上选择悬臂运动的长度。将 Z 移动设置为恒定持续时间。

将延长时间设置为 1 秒，拉伸和收回延迟为零。将采样率设置为 5， 000 赫兹。在 Z 闭环前面标记一个刻度，以在测量过程中自动调整样品和悬臂尖端之间的距离。

然后通过取消选择接合按钮来脱离电动载物台控制。打开激光并用悬臂接近样品。单击开始扫描以收集力距离曲线。

使用开源软件AtomicJ分析采集的数据。通过单击过程力曲线和映射图标，将力曲线加载到程序中。然后在处理助手中，通过单击添加按钮添加要分析的地图。

加载地图后，单击下一步。在下一个窗口中指定处理设置。要使用一组拟合曲线参数自动估计样品和悬臂之间的接触点，请使用接触点的自动估计。

通过经典的聚焦网格方法确定悬臂和样品之间的接触点。选择估计方法作为模型独立方法，根据实测力曲线的质量对接触点进行最佳确定，需要在数据分析优化时凭经验确定。使用经典模型拟合力压痕曲线，作为经典 L 二进行模型拟合。

将模型拟合到提款曲线。将泊松比设置为 0.45，建议用于肝脏等软组织。使用基线度 3 和接触度 1 设置曲线的拟合。

根据曲线与模型的偏差尺度更改多项式拟合度。选择用于拟合提款曲线的模型作为 Sneddon 模型。将球形尖端的半径填充到 2.9 微米。

通过启用读入从数据文件加载弹簧常量和 invOLS，然后单击完成。数据分析后，通过力曲线。排除悬臂错误地接近肝切片表面的力曲线。

这些曲线具有高噪声和异常形状。在此之后，可以复制或导出数据。在本研究中，用AFM探测从对照小鼠和注射四氯化碳诱导的轻度和晚期纤维化的小鼠获得的轻度固定肝切片。

在对照肝脏中分析与四氯化碳小鼠中胶原纤维通常形成的区域相对应的中央静脉附近的区域。杨氏模量的分布在单个肝脏切片的对照肝脏和富含胶原蛋白的区域的不同区域是可重复的。在四氯化碳处理的小鼠中，与对照小鼠的等效区域相比，对应于胶原蛋白沉积物中心周围区域的硬度图显示杨氏模量值显着更高。

此外，随着处理时间的延长，杨氏模量值显著增加。还评估了长期储存肝切片对胶原纤维机械性能的影响。AFM测量显示，与两周内获得的切片相比，储存三个月的切片富含胶原蛋白区域的杨氏模量值显着降低。

肝切片的固定时间在很大程度上决定了肝脏切片的力学性能。我们建议必须严格遵守协议中规定的时间间隔。在方案中进行某些优化后，给定的方法可用于任何显示显着胶原沉积的软组织，这可以通过偏振显微镜检测到。

给定的技术为研究人员提供了一个统一而方便的方案来研究肝脏在健康和疾病中的机制。