原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用

细胞和组织的生物力学特性调节其功能和活力。AFM 允许基于弹性测量在细胞水平上早期定量骨关节炎。AFM 允许在蜂窝电平采集测量值，而不会损坏样品，具有高分辨率、可靠性和灵敏度。

骨关节炎的早期发生生物力学属性变化。测量关节软骨的局部弹性，可以得出关于局部组织退化程度的有效结论。要评估人膝关节内的退行性变化，首先使用手术刀将关节软骨从亚骨骼中整体切割，并将软骨样本嵌入在 Cryotome 旋钮的水溶性嵌入介质中，该介质在低温下在 Cryotome 设备中冻结。

当样品冷冻时，使用标准的 Cryotome 从关节软骨的最顶层获取 35 微米厚的组织部分，将每个部分收集到单独的玻璃幻灯片上。获得所有部分后，每次洗涤用新鲜 PBS 冲洗样品三次，每次冲洗五分钟，以去除水溶性嵌入介质。从洗涤中拆下第一个幻灯片。

在此之后，将每节两到三滴生物相容样品胶水添加到单独的AFM兼容培养皿中。从样品中去除多余的溶液，轻轻将干燥部分的边缘压在粘合点上。两分钟后，用莱博维茨的L-15培养基小心地覆盖粘合组织，不带L-谷氨酰胺，将盘子放在细胞培养箱中，直到对样品进行分析。

要准备 AFM 设备，请调整用于在 AFM 支架上的液体环境中测量的气块，使上表面与支架平行，并使用钳子小心地将选定的悬臂安装到玻璃块表面，使带微球的 AFM 尖端突出在抛光光学平面上。要稳定玻璃块上的悬臂，请将金属弹簧滑入块的凹槽中，并使用钳子将悬臂顶部与弹簧夹住。小心地将带悬臂的玻璃块放在 AFM 头上，并集成锁定机构固定玻璃块。

然后将带悬臂的 AFM 头安装到 AFM 设备上，弹簧朝左。要将样品安装到 AFM 设备上，请将样品培养皿放在 AFM 样品支架上，然后将 Petri 盘加热器设置为 37 摄氏度。大约 20 分钟后，打开设备软件和激光对齐并接近参数设置窗口。

接下来，打开步进电机、激光和 CCD 摄像机，并使用步进电机功能以 100 微米步降悬臂，直到悬臂完全浸入介质中。使用调节螺钉将激光引导到悬臂顶部，并使用 AFM 设备螺钉调整激光束，使反射光束落在光电探测器的中心。一旦激光悬臂被调整，根据需要调整光电探测器，将总和信号设置为一伏或高，横向和垂直偏转接近零。

要获得校准力曲线，请使用表中所示的方法参数运行扫描仪方法。一旦达到组织培养皿的底部，将悬臂缩回100微米。设置表中所示的运行参数。

然后单击"运行"以开始测量并获取校准力距离曲线。力曲线如图所示。在校准力距离曲线上，选择缩回曲线的线性拟合区域。

一旦线性拟合就位，值将由软件保存。然后在37摄氏度的中等温度下进行测量时，将软件中的温度变量设置为37度，以尽可能密切地模拟生理条件。要识别软骨样本部分的通信模式，在相位对比显微镜上从骨关节炎膝关节膝上定位和识别关节软骨的特定细胞模式，其中可能包括指示健康组织区域的单弦、指示组织退化开始的双弦、指示晚期组织退化迹象的小簇和表示最终阶段组织破坏的大簇。

一旦确定了特定的所需模式，对于膜基测量，将悬臂定位在靠近细胞的位置，每个矩阵类型每个选择的图案测量两个站点，每个测量站点 9 次，包括足够大的样本大小，足以考虑可能的不准确。专注于要测量的模式的蜂窝矩阵，并在该点修复计算机鼠标。接下来，聚焦探头，将探针尖端移动到计算机箭头先前固定的点。

要对细胞外基质进行测量，请选择一个没有任何细胞的区域，然后执行一个缩回方法，使悬臂位于组织上方 100 微米。然后单击"运行"以启动测量，使用通过悬臂校准获得的设定点参数。要处理获得的数据，请打开与从AFM设备获得的数据兼容的数据处理软件，并在软件中选择赫斯特模型来处理力距离曲线。

将泊松比设置为 0.5，将尖端形状设置为球形，将尖端半径设置为 12.5 微米。一旦所有参数都进行了调整，结果将被安装，Young 的模组将由软件计算。沿着生理模型从字符串到双字符串，从小到大集群，细胞外和环状矩阵弹性模组在每个模式变化之间显著减少，除了字符串和双字符串之间。

此外，细胞外膜基质比没有显著变化，而细胞外基质和环状基质之间弹性的绝对差异显著降低。弹性值取决于各种条件，如压痕深度或悬臂尖端属性。因此，AFM 最适合比较同一实验设置中的不同条件。

当 AFM 测量样品的局部弹性时，需要固定各部分，以便进行精确测量并避免悬臂损坏。为了进一步分析组织弹性变化的过程，可以通过西方印迹或ELISA对感兴趣的蛋白质结构进行生化定量。