我们解决了船员对S1PRS的激活和药物重新计算情绪，EM操作和GI在HAB状态A M P A以及开发牢固针对S1PRS的药物的不太重要的基础进展，使得可以病毒化GP ZR刺激或居住的放大底漆，以及揭示T BCR靶向药物创造的正常结合位点的进一步益处。样品的质量是一切的基础 在正确的电镜实验中。简单制备的基本因素包括顺丰生产线销售的各种产品状态和N g浓度 演示该程序的将是我水平的研究生王合力。
对于蛋白质纯化，将此手指场景一磷酸受体或S one P R S G蛋白质复合物溶液加载到尺寸排阻色谱或S E C凝胶过滤柱中，在4摄氏度下以每分钟0.5毫升的流速预平衡。要将收集的馏分用于冷冻电子显微镜，请使用100千道尔顿截止浓度器在1， 300 XG和4摄氏度下浓缩它们。在粒子初步分类的二维分类数据处理过程中，选择Reliance On软件中的二维分类功能，然后单击IO选项中输入图像星形文件右侧的浏览。
然后选择粒子.star。接下来，在优化选项中，将类数设置为 100，将掩码直径 A 设置为 140。在计算选项中，将池化粒子的数量设置为 10，然后在将粒子复制到暂存目录字段中输入来自快速、快速本地驱动器的目录。
为了加快处理速度，请为使用的 GPU 加速选择“是”。对于良好 2D 结果作为模板的子集选择，请转到子集选择功能的 IO 选项，然后单击从 model.star 中选择类右侧的浏览。接下来，选择run_it025_model。
星号作为输入，然后单击弹出窗口中的运行，选中对图像进行排序和反向排序。然后点击显示。选择具有代表性的良好二维结果作为自动拾取功能的参考后，右键单击并选择保存所选类。
要将模板用于第二轮自动拣选，请转到自动拣选功能的IO选项。单击输入显微照片右侧的浏览以进行自动选取，然后选择显微照片.star。然后单击 2D 参考右侧的浏览并选择 class_averages.star。
此外，在高斯中选择 no 或使用 leplossian。接下来，使用绳索下划线后缀下划线自动拾取.star执行粒子提取。使用粒子执行 2D 分类。
星号，然后使用运行下划线 20 five_optimizer进行子集选择。星星 对于粒子提取，在 IO 选项中单击显微照片星形文件右侧的浏览后，选择显微照片。星标并选择“是”或重新提取精炼颗粒。
单击优化粒子星形文件右侧的浏览后，选择粒子。星形 要生成初始 3D 模型和参考地图，请单击 IO 选项中输入图像星形文件右侧的 3D 初始模型浏览，然后选择上一个 Particles.star。然后在优化选项中，将类数设置为 1，将掩码直径 A 设置为 140。
用于 3D 分类并在选择粒子后生成初步 3D 地图。星形 如前所述，单击参考地图右侧的浏览，然后选择初始下划线模型点 MRC。然后，在优化选项中，将类数设置为 4 到 6，将掩码直径 A 设置为 140。
对于掩码生成，在 IO 选项中选择良好的 3D 贴图作为输入后，将初始二值化阈值设置为 0.05，并将二进制贴图扩展到此多个像素设置为 3。接下来，转到掩码选项并设置。将柔和边缘添加到这许多像素到 8 个。
对于下一个处理，打开Trino Spark软件，创建一个新的工作区，然后单击第一个作业的作业生成器。要导入粒子堆栈，请在粒子元路径字段中输入粒子路径，在粒子数据路径字段中输入电影路径。接下来，通过在体积数据路径中输入之前生成的最佳 3D 体积的路径，并为要导入的卷类型选择掩码来导入 3D 体积。
对于非均匀细化，将先前生成的导入下划线粒子拖动为非均匀细化粒子粒子的输入。导入下划线体积，下划线 1 作为非均匀细化体积的输入，导入下划线掩码下划线 1 作为非均匀细化掩码的输入。面具。接下来，单击 Q 开始处理并重复该过程以获得良好的分辨率。
S1PRGI 3D 地图。质粒构建和瞬时转染制备后，将2微克制备好的DNA加入200微升转染试剂缓冲液中。通过涡旋 10 秒钟并在使用前短暂旋转混合物来混合。
加入四微升转染试剂，如前所述通过涡旋和旋转进行混合。将试管在室温下孵育15分钟后，将200微升转染混合物缓慢滴入含有CHOK 1细胞的六孔板的每个孔中，轻轻摇动板或彻底混合。孵育4至6小时后，将转染培养基替换为由F 12培养基和10%fbs组成的细胞生长培养基，然后将板送回培养箱。
细胞横断收获后24至48小时，将细胞悬浮在三毫升含有D荧光法钾盐的SA缓冲液中。然后使用多通道移液器，将90微升细胞悬液加入到轻轻混合的96孔板的每个孔中，并在室温下孵育40分钟。对于荧光信号测定，首先，在D M S O中制备辛波莫德的10毫摩尔储备溶液，然后在含有25微摩尔福斯卡林的H B S S缓冲液中进行连续稀释，并用10微升各种浓度的该激动剂溶液刺激细胞30分钟。
接下来，通过选择发光作为检测方法来计数酶标仪中的发光信号。相关软件中读取类型的端点和光学类型的发光光纤。此外，将光学增益设置为 255。
然后将获得的荧光信号值导入电子表格程序，并使用非线性回归曲线拟合剂量响应函数处理数据。S1PRS GI复合物可通过体积排阻色谱法成功纯化，并通过SDS页面验证。此外，本研究中遵循的电子显微镜方案可有效区分具有清晰且定义明确的2D类别的S1PRSGI颗粒和质量差的颗粒。
此外，通过非均匀细化，通过毛皮壳相关性可以生成具有良好分辨率的S1PR3 GI电子显微镜图。结构分析后，通过用受体和传感器质粒转染C H O K 一细胞进行S one P R 3的功能测定，结果表明受体质粒与传感器质粒的比例为1-3，可产生最佳结果。然而，在 2 93 个细胞中的结果不太现实 在该过程中，颗粒部分以及 2D 和 3D 分类部分中算法的选择对于解决 so MPS G 蛋白复合物非常重要，尤其是对于泄漏和 ECFS 建模。
