Abordamos los estados de ánimo de activación y recálculo de drogas de S1PRS por parte de la tripulación, las manipulaciones EM y el estado de rehabilitación gastrointestinal A M P A y una base menos significativa para desarrollar un medicamento que se dirija sólidamente a S1PRS Los avances en hacen posible virulizar las pinturas magnísticas de la estimulación o habitación de GP ZR y otros beneficios en el descubrimiento de los sitios de unión normales para la creación de medicamentos dirigidos a T BCR. La calidad de la muestra es la base de todo en el experimento EM correcto. Los factores esenciales para una preparación simple incluyen varios estados de producto de venta de línea SF y una concentración de N g Demostrando el procedimiento estará Heli Wang un estudiante graduado de mi nivel.
Para la purificación de proteínas carga este dedo escena uno receptores de fosfato o S uno P R S G solución de complejo de proteína a una cromatografía de exclusión de tamaño o columna de filtración de gel S E C pre equilibrada con tampón S E C a una velocidad de flujo de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados centígrados. Para utilizar las fracciones recogidas para la criomicroscopía electrónica, concéntrelas utilizando un concentrador de corte de 100 kilodalton a 1.300 XG a cuatro grados centígrados. Durante el procesamiento de datos para la clasificación 2D en la clasificación preliminar de partículas, elija la función de clasificación 2D en el software Rely On y haga clic en buscar a la derecha del archivo de estrella de imágenes de entrada en la opción IO.
A continuación, elija particles.star. A continuación, en la opción de optimización, establezca el número de clases en 100 y el diámetro de máscara A en 140. En la opción de cálculo, establezca el número de partículas agrupadas en 10 e introduzca el directorio desde una unidad local rápida y rápida en el campo copiar partícula a directorio de borrador.
Para un procesamiento más rápido, seleccione sí para la aceleración de GPU utilizada. Para la selección de subconjuntos de buenos resultados 2D como plantillas, vaya a la opción IO de la función de selección de subconjuntos y haga clic en buscar a la derecha de seleccionar clases de model.star. A continuación, elija run_it025_model.
Estrella como entrada y haga clic en Ejecutar en la ventana emergente Marque Ordenar imágenes y Ordenar inversamente. Luego haga clic en pantalla. Después de elegir buenos resultados 2D representativos como referencia para referencia de la función de selección automática, haga clic con el botón derecho y seleccione guardar las clases seleccionadas.
Para usar la plantilla para la segunda ronda de selección automática, vaya a la opción IO de la función de selección automática. Haga clic en buscar a la derecha de las micrografías de entrada para la selección automática y elija micrographs.star. Luego haga clic en buscar a la derecha de referencias 2D y elija class_averages.star.
Además, seleccione no para o use leplossian en de Gaussian. A continuación, realice la extracción de partículas utilizando el sufijo de subrayado de cordón underscore auto pick.star. Realizar clasificación 2D utilizando partículas.
estrella, seguido de la selección de subconjuntos usando run subrayado cero 20 five_optimizer. star Para la extracción de partículas, después de hacer clic en Examinar a la derecha del archivo de estrella de micrografía en la opción IO, elija micrografías. Estrella y seleccione Sí para o Re extraer partículas refinadas.
Después de hacer clic en examinar a la derecha del archivo de estrella de partículas refinadas, seleccione partículas. estrella para generar un modelo 3D inicial y un mapa de referencia, haga clic en examinar el modelo inicial 3D a la derecha del archivo de estrella de imágenes de entrada en la opción IO y elija el particles.star anterior. Luego, en la opción de optimización, establezca el número de clases en una y el diámetro de máscara A en 140.
Para la clasificación 3D y la generación de un mapa 3D preliminar, después de seleccionar partículas. Estrella Como se demostró anteriormente, haga clic en Examinar a la derecha del mapa de referencia y elija el modelo de subrayado inicial punto MRC. A continuación, en la opción de optimización, establezca el número de clases de cuatro a seis y el diámetro de máscara A en 140.
Para la generación de máscaras, después de seleccionar un buen mapa 3D como entrada en la opción IO, establezca el umbral de binarización inicial en 0.05 y extienda el mapa binario a esta cantidad de píxeles a tres. A continuación, vaya a la opción de máscara y configúrelo. Agregue borde suave a esta cantidad de píxeles a ocho.
Para el siguiente procesamiento, abra el software Trino Spark, cree un nuevo espacio de trabajo y haga clic en el creador de trabajos para el primer trabajo. Para importar la pila de partículas, introduzca la ruta de la partícula en el campo de ruta meta de partículas y la ruta de películas en el campo de ruta de datos de partículas. A continuación, importe volúmenes 3D introduciendo la ruta del mejor volumen 3D generado antes en la ruta de datos del volumen y seleccionando máscara para el tipo de volumen que se importa.
Para un refinamiento no uniforme, arrastre las partículas de subrayado importadas generadas previamente como la entrada de partículas de refinamiento no uniformes. Volumen de subrayado importado, subrayado uno como entrada de volumen de refinamientos no uniformes y máscara de subrayado importada subrayado uno como entrada de máscara de refinamientos no uniformes. Máscara. A continuación, haga clic en Q para iniciar el procesamiento y repita el procedimiento para obtener una buena resolución.
Mapa 3D de S1PRGI. Después de la construcción del plásmido y la preparación para la transfección transitoria, agregue dos microgramos de ADN preparado en 200 microlitros de tampón de reactivo de transfección. Mezclar por vórtice durante 10 segundos y girar la mezcla brevemente antes de usar.
Agregue cuatro microlitros de reactivo de transfección y mézclelo con vórtice y giro como se demostró anteriormente. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos, deje caer lentamente 200 microlitros de la mezcla de transfección en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga células CHOK one y agite suavemente la placa o mezcle bien. Después de cuatro a seis horas de incubación, reemplace el medio de transfección con el medio de crecimiento celular que consiste en medio F 12 y 10% fbs antes de devolver la placa a la incubadora.
24 a 48 horas después de la recolección de la transección de las células, suspender las células en tres mililitros de un tampón SA con sal de potasio D luciferino. Luego, usando una pipeta multicanal, agregue 90 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos mezclada suavemente e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos. Para la determinación de la señal de fluorescencia, primero, prepare 10 soluciones madre milimolares de siponimod en D M S O.Luego haga una dilución en serie en tampón H B S S que contiene 25 micromolares de forscalina y estimule las células con 10 microlitros de varias concentraciones de esta solución agonista durante 30 minutos.
A continuación, cuente la señal de luminiscencia en un lector de microplacas seleccionando luminiscencia para el método de detección. Endpoint para tipo de lectura y fibra de luminiscencia para tipo óptico en el software asociado. Además, establezca la ganancia óptica en 255.
A continuación, importe los valores de señal de fluorescencia obtenidos en un programa de hoja de cálculo y procese los datos utilizando la función de respuesta a la dosis de ajuste de la curva de regresión no lineal. El complejo GI S1PRS pudo purificarse con éxito mediante cromatografía de exclusión de tamaño, que fue verificada por la página SDS. Además, el protocolo de microscopía electrónica seguido en este estudio fue eficaz para diferenciar entre partículas S1PRSGI con clases 2D claras y bien definidas y partículas de mala calidad.
Además, se podría generar un mapa de microscopía electrónica de S1PR3 GI con una buena resolución mediante la correlación de la cáscara del peletero a través del refinamiento no uniforme. Después del análisis estructural, se realizaron ensayos funcionales para S one P R tres mediante transfección de células C H O K ONE con plásmidos receptores y sensores, lo que reveló que la relación plásmido receptor a plásmido sensor de uno a tres produce resultados óptimos. Sin embargo, los resultados fueron menos realistas en 2 93 células En ese procesamiento, la elección de algoritmos en la sección de partículas y la sección de clasificación 2D y 3D es importante para resolver los complejos de proteínas MPS G, especialmente para modelar las fugas y ecfs.
