התייחסנו למצבי הרוח של הפעלה וחישוב מחדש של תרופות של S1PRS על ידי צוות, מניפולציות EM ו- GI inhab state A M P A ובסיס פחות משמעותי לפיתוח תרופה שמכוונת באופן מוצק ל- S1PRS Advancements בכך שמאפשרת להפוך את האנדרדוגיות המגנטיות של גירוי או מגורים של GP ZR ויתרונות נוספים בחשיפת אתרי הקשירה הרגילים ליצירת תרופות ממוקדות T BCR. איכות המדגם היא הבסיס לכל דבר בניסוי EM הנכון. הגורמים החיוניים להכנה פשוטה כוללים מצב מוצר שונים של מכירת קו SF וריכוז N g המדגים את ההליך יהיה חלי וואנג סטודנט לתואר שני מהרמה שלי.
עבור טיהור חלבון עומס זה אצבע סצנה קולטני פוספט אחד או S אחד P R S G חלבון מורכב פתרון לכרומטוגרפיה אי הכללת גודל או S E C ג'ל סינון עמודה מראש שיווי משקל עם מאגר S E C בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להשתמש בשברים שנאספו עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו, רכז אותם באמצעות רכז חיתוך של 100 קילודלטון ב-1, 300 XG בארבע מעלות צלזיוס. במהלך עיבוד נתונים לסיווג דו-ממדי בסיווג הראשוני של חלקיקים, בחר את פונקציית הסיווג הדו-ממדית בתוכנת Rely On ולחץ על דפדף מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO.
לאחר מכן בחר את החלקיקים.כוכב. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות ל -100 ואת קוטר המסכה A ל -140. באפשרות המחשוב, הגדר את מספר החלקיקים המאוגדים ל-10 והזן את הספריה מכונן מקומי מהיר ומהיר בשדה ספריית ההעתקה לשדה ספריית הגירוד.
לעיבוד מהיר יותר, בחר כן להאצת GPU בשימוש. לבחירת תת-ערכה של תוצאות דו-ממדיות טובות כתבניות, עבור אל האפשרות IO של פונקציית בחירת תת-ערכה ולחץ על דפדף מימין למחלקות נבחרות מ- model.star. לאחר מכן, בחר run_it025_model.
כוכב כקלט ולחץ על הפעל בחלון הקופץ בדוק מיין תמונות במיון הפוך ומיון לאחור. לאחר מכן לחץ על תצוגה. לאחר בחירת תוצאות דו-ממדיות מייצגות טובות כהפניה להפניה לפונקציית הבחירה האוטומטית, לחץ לחיצה ימנית ובחר שמור מחלקות נבחרות.
כדי להשתמש בתבנית עבור הסיבוב השני של בחירה אוטומטית, עבור אל אפשרות IO של פונקציית בחירה אוטומטית. לחץ על דפדף משמאל למיקרוגרפים של קלט לבחירה אוטומטית, ובחר micrographs.star. לאחר מכן לחץ על דפדף מימין להפניות דו-ממדיות ובחר class_averages.star.
כמו כן, בחר לא עבור או השתמש leplossian ב של גאוס. לאחר מכן, בצע חילוץ חלקיקים באמצעות סיומת קו תחתון כבל תחתון auto pick.star. בצע סיווג דו-ממדי באמצעות חלקיקים.
כוכב, ואחריו בחירת תת-קבוצה באמצעות קו תחתון ריצה זה אפס 20 five_optimizer. כוכב לחילוץ חלקיקים, לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ כוכב המיקרוגרף באפשרות IO, בחר מיקרוגרפים. כוכב ובחר כן עבור או לחלץ מחדש חלקיקים מזוקקים.
לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ הכוכבים של החלקיקים המזוקקים, בחר חלקיקים. כוכב ליצירת מודל תלת-ממדי ראשוני ומפת ייחוס, לחץ על עיון במודל הראשוני התלת-ממדי מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO ובחר את החלקיקים הקודמים.star. לאחר מכן באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לאחת ואת קוטר המסכה A ל -140.
לסיווג תלת מימדי ויצירת מפה תלת-ממדית ראשונית, לאחר בחירת חלקיקים. כוכב כפי שהודגם קודם לכן, לחץ על דפדף מימין למפת ההפניה ובחר קו תחתון ראשוני דגם נקודה MRC. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לארבע עד שש ואת קוטר המסכה A ל- 140.
ליצירת מסיכות, לאחר בחירת מפה תלת-ממדית טובה כקלט באפשרות IO, הגדר את סף הבינאריזציה הראשוני ל- 0.05, ואת המפה הבינארית הרחבה לפיקסלים רבים אלה לשלושה. לאחר מכן, עבור אל אפשרות המסכה והגדר. הוסף קצה רך לפיקסלים רבים אלה לשמונה.
לעיבוד הבא, פתח את תוכנת Trino Spark, צור סביבת עבודה חדשה ולחץ על בונה המשרות עבור העבודה הראשונה. לייבוא ערימת החלקיקים, הזינו את נתיב החלקיקים בשדה מטא-נתיב החלקיקים ואת נתיב הסרטים בשדה נתיב נתוני החלקיקים. לאחר מכן, יבא אמצעי אחסון תלת-ממדיים על-ידי הזנת הנתיב של אמצעי האחסון התלת-ממדי הטוב ביותר שנוצר בעבר בנתיב נתוני אמצעי האחסון, ובחירת מסיכה עבור סוג אמצעי האחסון המיובא.
עבור עידון לא אחיד, גרור את חלקיקי הקו התחתון המיובאים שנוצרו קודם לכן כקלט של חלקיקי חידודים לא אחידים. נפח קו תחתון מיובא, קו תחתון אחד כקלט של נפח נפח חידודים לא אחידים ומסיכת קו תחתון מיובאת מדגישים אחד כקלט של מסיכת חידודים לא אחידה. מסכה. לאחר מכן, לחץ על Q כדי להתחיל בעיבוד ולחזור על ההליך כדי לקבל רזולוציה טובה.
S1PRGI 3D מפה. לאחר בניית פלסמיד והכנה להעברה חולפת, הוסף שני מיקרוגרם של דנ"א מוכן לתוך 200 מיקרוליטרים של מאגר מגיב טרנספקציה. מערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות ומסובבים את התערובת לזמן קצר לפני השימוש.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה וערבב אותו על ידי מערבולת וסיבוב כפי שהוכח קודם לכן. לאחר דגירה של הצינור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, יש לזרוק באיטיות 200 מיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה לתוך כל באר של צלחת שש בארות המכילה CHOK תא אחד ולנער בעדינות את הצלחת או ערבוב יסודי. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה, החלף את מדיום הטרנספקציה במדיום צמיחת התאים המורכב מ- F 12 בינוני ו- 10% fbs לפני החזרת הצלחת לאינקובטור.
24 עד 48 שעות לאחר קצירת התאים, להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של חיץ SA עם מלח אשלגן לוציפריאן D. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, הוסף 90 מיקרוליטרים של מתלה התא לכל באר של צלחת 96 באר מעורבב בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לקביעת אות פלואורסצנטי, ראשית, הכינו תמיסות מלאי של 10 מילימולאר של סיפונימוד ב- D M S O.ואז בצעו דילול סדרתי במאגר H B S S המכיל 25 מיקרומולר פורסקלין ועוררו את התאים עם 10 מיקרוליטרים של ריכוזים שונים של תמיסה אגוניסטית זו למשך 30 דקות.
לאחר מכן, לספור את אות luminescence בקורא microplate על ידי בחירת luminescence עבור שיטת זיהוי. נקודת קצה עבור סוג קריאה, וסיבי זוהר עבור סוג אופטיקה בתוכנה המשויכת. כמו כן, הגדר את רווח האופטיקה ל -255.
לאחר מכן ייבא את ערכי האות הפלואורסצנטי המתקבלים לתוכנית גיליון אלקטרוני, ועבד את הנתונים באמצעות פונקציית התגובה של עקומת הרגרסיה הלא ליניארית המתאימה למנה. קומפלקס S1PRS GI יכול להיות מטוהר בהצלחה על ידי כרומטוגרפיה אי הכללת גודל, אשר אומת על ידי דף SDS. יתר על כן, פרוטוקול מיקרוסקופיית האלקטרונים שנערך במחקר זה היה יעיל בהבחנה בין חלקיקי S1PRSGI עם מחלקות דו-ממדיות ברורות ומוגדרות היטב וחלקיקים באיכות ירודה.
יתר על כן, מפת מיקרוסקופיית אלקטרונים של S1PR3 GI עם רזולוציה טובה יכולה להיווצר על ידי קורלציה פרוותית יותר באמצעות עידון לא אחיד. לאחר ניתוח מבני, בדיקות פונקציונליות עבור S One P R שלוש נעשו על ידי טרנספקציה של C H O K תא אחד עם קולטן ופלסמידים חיישן, אשר גילה כי פלסמיד קולטן חיישן יחס פלסמיד של אחד לשלושה מייצר תוצאות אופטימליות. עם זאת, התוצאות היו פחות מציאותיות ב- heck 2 93 תאים בעיבוד זה, בחירת האלגוריתמים בסעיף החלקיקים והקטע של סיווג דו-ממדי ותלת-ממדי חשובה לפתרון קומפלקסי החלבון MPS G במיוחד עבור מידול הדליפות וה- ecfs.
