우리는 승무원에 의한 S1PRS의 활성화 및 약물 재계산 기분, EM 조작 및 GI 인하 상태 A M P A 및 S1PRS를 견고하게 표적으로 하는 약물 개발을 위한 덜 중요한 기반을 다루었습니다. GP ZR 자극 또는 거주의 마그니스틱 언더페인팅을 독성화할 수 있는 발전과 T BCR 표적 약물 생성을 위한 정상 결합 부위를 밝히는 데 있어 추가적인 이점이 있습니다. 샘플의 품질은 올바른 EM 실험에서 모든 것의 기초입니다. 간단한 준비를위한 필수 요소는 SF 라인 판매의 다양한 제품 상태와 N g 농도를 포함하며 절차를 시연하는 것은 내 수준의 대학원생 Heli Wang이 될 것입니다.
단백질 정제를 위해 이러한 핑거씬원 포스페이트 수용체 또는 S하나의 PRS G 단백질 복합체 용액을 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 겔 여과 컬럼에 로딩하여 섭씨 4도에서 분당 0.5 밀리리터의 유속으로 SEC 완충액과 미리 평형화시켰다. 수집 된 분획을 초저온 전자 현미경 검사에 사용하려면 섭씨 4도에서 1, 300 XG에서 100 킬로 달톤 컷오프 농축기를 사용하여 농축하십시오. 파티클의 예비 분류에서 2D 분류를 위한 데이터 처리 중에 Reli On 소프트웨어에서 2D 분류 기능을 선택하고 IO 옵션에서 입력 이미지 스타 파일 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭합니다.
그런 다음 입자.별을 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 100으로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다. compute 옵션에서 풀링된 파티클 수를 10으로 설정하고 빠르고 빠른 로컬 드라이브의 디렉터리를 스크래치로 파티클 복사 필드에 입력합니다.
더 빠른 처리를 위해 사용된 GPU 가속에 대해 예를 선택합니다. 템플릿으로 좋은 2D 결과의 하위 집합을 선택하려면 하위 집합 선택 기능의 IO 옵션으로 이동하여 model.star에서 선택한 클래스의 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하십시오. 그런 다음 run_it025_model 선택합니다.
입력으로 별표를 표시하고 팝업 창에서 실행을 클릭하여 이미지 정렬 및 역 정렬을 선택합니다. 그런 다음 디스플레이를 클릭하십시오. 자동 선택 기능의 참조를 위한 참조로 좋은 대표 2D 결과를 선택한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택한 클래스 저장을 선택합니다.
자동 피킹의 두 번째 라운드에 템플릿을 사용하려면 자동 피킹 기능의 IO 옵션으로 이동하십시오. 자동 선택을 위해 입력 현미경 사진 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 micrographs.star를 선택합니다. 그런 다음 2D 참조 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하고 class_averages.star를 선택하십시오.
또한 가우스의 경우 아니오를 선택하거나 leplossian을 사용하십시오. 다음으로, 코드 밑줄 접미사 밑줄 autopick.star를 사용하여 입자 추출을 수행합니다. 입자를 사용하여 2D 분류를 수행합니다.
별표, run을 사용하여 하위 집합 선택 밑줄을 긋고 20 five_optimizer 0으로 표시합니다. 별 입자 추출의 경우 IO 옵션에서 현미경 사진 별 파일 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭한 후 현미경 사진을 선택합니다. 별표를 표시하고 정제된 입자에 대해 예 또는 다시 추출을 선택합니다.
정제된 입자 별 파일의 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭한 후 입자를 선택합니다. 스타 초기 3D 모델 및 참조 맵을 생성하려면 IO 옵션에서 입력 이미지 스타 파일의 오른쪽에있는 3D 초기 모델 찾아보기를 클릭하고 이전 particles.star를 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 1로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다.
3D 분류 및 예비 3D 맵 생성의 경우, 입자를 선택한 후. 별표 앞에서 설명한 대로 참조 맵의 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 초기 밑줄 모델 dot MRC를 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 4-6으로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다.
마스크 생성의 경우 IO 옵션에서 입력으로 좋은 3D 맵을 선택한 후 초기 이진화 임계값을 0.05로 설정하고 이 픽셀 수로 이진 맵을 확장하는 것을 3으로 설정합니다. 다음으로 마스크 옵션으로 이동하여 설정하십시오. 이 많은 픽셀에 부드러운 가장자리를 8로 추가합니다.
다음 처리를 위해 Trino Spark 소프트웨어를 열고 새 작업 영역을 만든 다음 첫 번째 작업에 대해 작업 빌더를 클릭합니다. 파티클 스택을 가져오려면 파티클 메타 경로 필드에 파티클 경로를 입력하고 파티클 데이터 경로 필드에 동영상 경로를 입력합니다. 다음으로, 볼륨 데이터 경로에 이전에 생성된 최상의 3D 볼륨의 경로를 입력하고 가져올 볼륨 유형에 대한 마스크를 선택하여 3D 볼륨을 가져옵니다.
불균일 미세 조정의 경우 이전에 생성된 가져온 밑줄 입자를 불균일 미세 조정 입자 입자의 입력으로 드래그합니다. 가져온 밑줄 볼륨은 불균일 구체화 볼륨 볼륨의 입력으로 밑줄 하나를 강조하고 가져온 밑줄 마스크는 균일하지 않은 미세 조정 마스크의 입력으로 하나를 밑줄입니다. 마스크. 그런 다음 Q를 클릭하여 처리를 시작하고 절차를 반복하여 좋은 해상도를 얻습니다.
S1PRGI 3D 지도. 플라스미드 구축 및 일시적 형질주입을 위한 준비 후, 200 마이크로리터의 형질주입 시약 완충액 내로 2 마이크로그램의 준비된 DNA를 첨가한다. 10 초 동안 볼텍싱하고 사용하기 전에 혼합물을 잠시 회전시켜 혼합하십시오.
4 마이크로 리터의 형질 주입 시약을 추가하고 이전에 시연 된대로 와류 및 회전으로 혼합하십시오. 튜브를 실온에서 15분 동안 배양한 후, CHOK 하나의 세포를 함유하는 6웰 플레이트의 각 웰에 형질주입 믹스 200 마이크로리터를 천천히 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 흔들거나 완전히 혼합한다. 4 내지 6시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시키기 전에 형질주입 배지를 F12 배지 및 10%fbs로 구성된 세포 성장 배지로 교체한다.
세포의 절편 수확 후 24 내지 48시간에, 세포를 D 루시퍼 칼륨 염과 함께 3 밀리리터의 SA 완충액에 현탁시킨다. 이어서 멀티채널 피펫을 사용하여, 90 마이크로리터의 세포 현탁액을 부드럽게 혼합된 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다. 형광 신호 측정을 위해, 첫째로, DM S O.그런 다음 25 마이크로몰 포스칼린을 포함하는 H B S S 완충액에 있는 연속적인 희석을 만들고 30 분 동안 이 작용제 해결책의 각종 농도의 10 마이크로리터로 세포를 자극하십시오.
다음으로, 검출 방법을 위해 발광을 선택하여 마이크로플레이트 판독기에서 발광 신호를 계수한다. 판독 유형에 대한 엔드포인트 및 연관된 소프트웨어의 광학 유형에 대한 발광 광섬유. 또한 광학 게인을 255로 설정합니다.
그런 다음 얻은 형광 신호 값을 스프레드시트 프로그램으로 가져오고 비선형 회귀 곡선 적합 선량 반응 함수를 사용하여 데이터를 처리합니다. S1PRS GI 복합체는 크기 배제 크로마토그래피로 성공적으로 정제될 수 있었고, 이는 SDS 페이지에 의해 검증되었다. 또한, 이 연구에서 따랐던 전자 현미경 프로토콜은 명확하고 잘 정의된 2D 등급의 S1PRSGI 입자와 품질이 낮은 입자를 구별하는 데 효과적이었습니다.
또한, 우수한 해상도를 가진 S1PR3 GI의 전자 현미경 맵은 불균일 한 정제를 통한 더 많은 껍질 상관 관계에 의해 생성 될 수 있습니다. 구조 분석 후, S 1 PR3에 대한 기능 분석은 CHO K 하나의 세포를 수용체 및 센서 플라스미드로 형질감염시킴으로써 수행되었으며, 이는 1 대 3의 수용체 플라스미드 대 센서 플라스미드 비가 최적의 결과를 생성한다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 그 처리에 있어서는 도대체 2 93 세포에서 결과가 덜 현실적이었고, 입자 절편과 2D 및 3D 분류의 단면에서의 알고리즘 선택은 특히 유출 및 ecfs를 모델링하기 위한 MPS G 단백질 복합체를 해결하는 데 중요하다.
