Abordamos os humores de ativação e recálculo de medicamentos do S1PRS por tripulação, manipulações em EM e estado inhab A M P A e base menos significativa para o desenvolvimento de uma droga que visa solidamente os avanços do S1PRS para tornar possível virulizar subpinções magnísticas de estimulação ou habitação gp ZR e outros benefícios na descoberta dos locais de ligação normal para a criação de medicamentos direcionados à T BCR. A qualidade da amostra é a base para tudo no experimento EM correto. Os fatores essenciais para uma preparação simples incluem vários estados de produtos da venda da linha SF e uma concentração N g Demonstrando que o procedimento será Heli Wang um estudante de pós-graduação do meu nível.
Para a purificação de proteínas carregue esta cena do dedo um receptor de fosfato ou solução complexa de proteína S one P R S G para uma cromatografia de exclusão de tamanho ou coluna de filtragem de gel S E C pré-equilibrada com tampão S E C a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius. Para usar as frações coletadas para microscopia crio-elétron concentre-as usando um concentrador de corte de 100 kilodalton a 1.300 XG a quatro graus Celsius. Durante o processamento de dados para classificação 2D na classificação preliminar de partículas, escolha a função de classificação 2D no software Rely On e clique em procurar à direita do arquivo estrela de imagens de entrada na opção IO.
Então escolha as partículas.estrela. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para 100 e o diâmetro da máscara de A para 140. Na opção de computação, defina o número de partículas agrupadas para 10 e entre no diretório de uma unidade local rápida e rápida na partícula de cópia para arranhar o campo do diretório.
Para um processamento mais rápido, selecione sim para aceleração de GPU usada. Para seleção de subconjuntos de bons resultados 2D como modelos, vá para a opção IO da função de seleção de subconjunto e clique em procurar à direita de classes selecionadas do model.star. Em seguida, escolha run_it025_model.
estrela como entrada e clique em executar na janela pop-up verificar imagens de classificação e reverter tipo. Em seguida, clique no visor. Depois de escolher bons resultados 2D representativos como referência para referência da função de escolha automática, clique com o botão direito do mouse e selecione salvar classes selecionadas.
Para usar o modelo para a segunda rodada de auto-colheita, vá para a opção IO de função de escolha automática. Clique em procurar à direita de micrografos de entrada para escolher automaticamente e escolha micrografias.star. Em seguida, clique em procurar à direita de referências 2D e escolha class_averages.star.
Além disso, selecione não para ou use leplossian em gaussiano. Em seguida, realize a extração de partículas usando o sufixo de sublinhar o sufixo de sublinhar auto pick.star. Realize a classificação 2D usando partículas.
estrela, seguido por seleção subconjunto usando corrida sublinhar zero 20 five_optimizer. estrela Para extração de partículas, depois de clicar em procurar à direita do arquivo estrela de micrografo na opção IO, escolha micrografias. estrela e selecionar sim para ou re extrair partículas refinadas.
Depois de clicar em procurar à direita do arquivo estelar de partículas refinadas, selecione partículas. estrela para gerar um modelo 3D inicial e um mapa de referência, clique em procurar o modelo inicial 3D à direita do arquivo estrela de imagens de entrada na opção IO e escolha as partículas anteriores.star. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para uma e o diâmetro da máscara de A para 140.
Para classificação 3D e geração de um mapa 3D preliminar, após a seleção de partículas. estrela como demonstrado anteriormente, clique em navegar para a direita do mapa de referência e escolha o modelo de sublinhação inicial dot mrc. Em seguida, na opção de otimização, defina o número de classes para quatro a seis e o diâmetro da máscara de A para 140.
Para a geração de máscaras, depois de selecionar um bom mapa 3D como entrada na opção IO, defina o limiar inicial de binarização para 0,05, e o mapa binário estendido para estes muitos pixels para três. Em seguida, vá para a opção máscara e definir. Adicione borda macia a estes muitos pixels a oito.
Para o próximo processamento, abra o software Trino Spark, crie um novo espaço de trabalho e clique em job builder para o primeiro trabalho. Para importar a pilha de partículas, entre no caminho de partículas no campo meta caminho de partículas e no caminho dos filmes no campo do caminho de dados de partículas. Em seguida, importe volumes 3D inserindo o caminho do melhor volume 3D gerado antes no caminho de dados de volume e selecionando máscara para o tipo de volume que está sendo importado.
Para refinamento não uniforme, arraste as partículas de sublinhamento importadas anteriormente geradas como a entrada de partículas de partículas de refinamento não uniforme. O volume de sublinhado importado, ressalta um como a entrada de refinamentos não uniformes volume de volume e máscara de sublinhado importado sublinha um como a entrada de máscara de refinamentos não uniformes. Máscara. Em seguida, clique em Q para iniciar o processamento e repita o procedimento para obter uma boa resolução.
Mapa 3D S1PRGI. Após a construção plasmida e preparação para transfecção transitória, adicione dois microgramas de DNA preparado em 200 microliters de tampão reagente transfeccionado. Misture por vórtice por 10 segundos e girando a mistura brevemente antes de usar.
Adicione quatro microliters de reagente de transfecção e misture-o por vórtice e fiação como demonstrado anteriormente. Depois de incubar o tubo à temperatura ambiente por 15 minutos, solte lentamente 200 microliters da mistura de transfecção em cada poço de uma placa de seis poços contendo chok uma células e agite suavemente a placa ou misture completamente. Após quatro a seis horas de incubação, substitua o meio de transfecção pelo meio de crescimento celular composto por F 12 médio e 10% fbs antes de devolver a placa à incubadora.
24 a 48 horas após a colheita pós-transeção das células, suspender as células em três mililitros de um tampão SA com sal de potássio d luciferiano. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 90 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços misturada suavemente e incubada à temperatura ambiente por 40 minutos. Para determinação do sinal de fluorescência, primeiro, prepare 10 soluções de estoque mililitro de siponimod em D M S O.Em seguida, faça uma diluição serial no tampão H B S S S contendo 25 forscalina micromolar e estimule as células com 10 microlitres de várias concentrações desta solução agonista por 30 minutos.
Em seguida, conte o sinal de luminescência em um leitor de microplaca selecionando luminescência para método de detecção. Ponto final para tipo de leitura e fibra de luminescência para tipo de óptica no software associado. Além disso, definir a óptica ganhar para 255.
Em seguida, importe os valores do sinal de fluorescência obtidos em um programa de planilha e processe os dados usando a função de resposta de dose de dose de curva de regressão não linear. O complexo S1PRS GI poderia ser purificado com sucesso por cromatografia de exclusão de tamanho, que foi verificada pela página da SDS. Além disso, o protocolo de microscopia eletrônica seguido neste estudo foi eficaz na diferenciação entre partículas S1PRSGI com classes 2D claras e bem definidas e partículas de má qualidade.
Além disso, um mapa de microscopia eletrônica de S1PR3 GI com uma boa resolução poderia ser gerado pela correlação da casca furrier através de refinamento não uniforme. Após análise estrutural, ensaios funcionais para S one P R três foram feitos por transfecção de C H O K uma célula com plasmídeos receptor e sensor, que revelou que o plasmídeo receptor para a razão plasmida sensor de um a três produz resultados ótimos. No entanto, os resultados foram menos realistas em 2 93 células Nesse processamento, a escolha de algoritmos na seção de partículas e a seção de classificação 2D e 3D é importante para a resolução dos complexos proteicos MPS G especialmente para modelagem dos vazamentos e ecfs.
