Wir befassten uns mit den Aktivierungs- und Neuberechnungsstimmungen von S1PRS durch Besatzung, EM-Manipulationen und GI-Inhab-Zustand A M P A und weniger signifikanten Grundlagen für die Entwicklung eines Medikaments, das solide auf S1PRS abzielt. Fortschritte in ermöglichen es, magnistische Untermalungen der GP ZR-Stimulation oder -Besiedlung zu virulisieren, und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der normalen Bindungsstellen für die gezielte Wirkstoffherstellung von T BCR. Die Qualität der Probe ist die Grundlage für alles im richtigen EM-Experiment. Die wesentlichen Faktoren für eine einfache Zubereitung sind verschiedene Produktzustände des SF-Linienverkaufs und eine Ng-Konzentration Demonstration des Verfahrens wird Heli Wang, ein Doktorand von meinem Niveau, sein.
Zur Proteinreinigung laden diese Fingerszene einen Phosphatrezeptor oder eine S P R S G Proteinkomplexlösung auf eine Größenausschlusschromatographie oder S E C Gelfiltrationssäule voräquilibriert mit S E C Puffer bei einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute bei vier Grad Celsius. Um die gesammelten Fraktionen für die Kryoelektronenmikroskopie zu verwenden, konzentrieren Sie sie mit einem 100 Kilodalton Cutoff-Konzentrator bei 1,300 XG bei vier Grad Celsius. Während der Datenverarbeitung für die 2D-Klassifizierung in der vorläufigen Klassifizierung von Partikeln wählen Sie die 2D-Klassifizierungsfunktion in der Rely On-Software und klicken Sie rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option auf Durchsuchen.
Wählen Sie dann den particles.star. Legen Sie anschließend in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf 100 und den Maskendurchmesser A auf 140 fest. Legen Sie in der Berechnungsoption die Anzahl der gepoolten Partikel auf 10 fest und geben Sie das Verzeichnis von einem schnellen, schnellen lokalen Laufwerk in das Feld Partikel in Scratch-Verzeichnis kopieren ein.
Für eine schnellere Verarbeitung wählen Sie Ja für die verwendete GPU-Beschleunigung. Für die Teilmenge Auswahl von guten 2D-Ergebnissen als Vorlagen, gehen Sie zur IO-Option der Teilmengenauswahlfunktion und klicken Sie auf Navigieren rechts neben wählen Sie Klassen von model.star. Wählen Sie als Nächstes run_it025_model.
Als Eingabe markieren und im Popup-Fenster auf Ausführen klicken, Bilder sortieren auf und umgekehrt sortieren. Klicken Sie dann auf Display. Nachdem Sie gute repräsentative 2D-Ergebnisse als Referenz für die Auto-Picking-Funktion ausgewählt haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie ausgewählte Klassen speichern.
Um die Vorlage für die zweite Runde der automatischen Kommissionierung zu verwenden, gehen Sie zur IO-Option der automatischen Kommissionierfunktion. Klicken Sie rechts neben Mikroaufnahmen für die automatische Auswahl auf Durchsuchen und wählen Sie micrographs.star aus. Klicken Sie dann rechts neben 2D-Referenzen auf Durchsuchen und wählen Sie class_averages.star.
Wählen Sie außerdem Nein für oder verwenden Sie Leplossian in von Gauß. Führen Sie als Nächstes die Partikelextraktion mit dem Schnurunterstrich-Suffix Unterstrich auto pick.star durch. Führen Sie eine 2D-Klassifizierung mit Partikeln durch.
Stern, gefolgt von Teilmengenauswahl mit Run Underscore It Zero 20 five_optimizer. Stern Wählen Sie für die Partikelextraktion rechts neben der Sterndatei des Mikrographen in der Option IO die Option Mikroskopische Aufnahmen aus. Stern und wählen Sie Ja für oder reextrahieren Sie raffinierte Partikel.
Nachdem Sie rechts neben der Sterndatei für raffinierte Partikel auf Navigieren geklickt haben, wählen Sie Partikel aus. Stern zum Generieren eines ersten 3D-Modells und einer Referenzkarte, klicken Sie auf Durchsuchen des 3D-Ausgangsmodells rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option und wählen Sie die vorherige particles.star. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf eine und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.
Zur 3D-Klassifizierung und Erstellung einer vorläufigen 3D-Karte nach Auswahl der Partikel. Stern Wie zuvor gezeigt, klicken Sie rechts neben der Referenzkarte auf Durchsuchen und wählen Sie Initial Underscore Model Dot MRC. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf vier bis sechs und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.
Setzen Sie für die Maskengenerierung nach Auswahl einer guten 3D-Karte als Eingabe in der IO-Option den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,05 und die binäre Karte auf so viele Pixel auf drei erweitern. Als nächstes gehen Sie zur Maskenoption und legen Sie fest. Fügen Sie dieser Anzahl von Pixeln bis acht eine weiche Kante hinzu.
Öffnen Sie für die nächste Bearbeitung die Trino Spark-Software, erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich und klicken Sie für den ersten Auftrag auf Job Builder. Um den Partikelstapel zu importieren, geben Sie den Partikelpfad in das Feld Partikelmetapfad und den Filmpfad in das Feld Partikeldatenpfad ein. Importieren Sie als Nächstes 3D-Volumes, indem Sie den Pfad des besten zuvor generierten 3D-Volumes in den Volume-Datenpfad eingeben und die Maske für den Typ des zu importierenden Volumes auswählen.
Für eine ungleichmäßige Verfeinerung ziehen Sie die zuvor generierten importierten Unterstrichpartikel als Eingabe von Partikelpartikeln mit ungleichmäßigen Verfeinerungen. Importiertes Unterstrichvolumen, Unterstrich eins als Eingabe des Volumenvolumens für ungleichmäßige Verfeinerungen und importierte Unterstrichmaske Unterstrich eins als Eingabe einer nicht gleichmäßigen Verfeinerungsmaske. Maske. Klicken Sie anschließend auf Q, um die Verarbeitung zu starten, und wiederholen Sie den Vorgang, um eine gute Auflösung zu erhalten.
S1PRGI 3D-Karte. Nach dem Plasmidaufbau und der Vorbereitung für die transiente Transfektion fügen Sie zwei Mikrogramm präparierte DNA in 200 Mikroliter Transfektionsreagenzpuffer hinzu. Mischen Sie durch Wirbeln für 10 Sekunden und drehen Sie die Mischung kurz vor Gebrauch.
Fügen Sie vier Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie es durch Vortexen und Spinnen, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, lassen Sie langsam 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte fallen, die CHOK-One-Zellen enthält, und schütteln Sie die Platte vorsichtig oder mischen Sie sie gründlich. Nach vier bis sechs Stunden Inkubation ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch das Zellwachstumsmedium, das aus F 12 Medium und 10% fbs besteht, bevor Sie die Platte in den Inkubator zurückbringen.
24 bis 48 Stunden nach der Transsektionsernte der Zellen suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter eines SA-Puffers mit D-luziferischem Kaliumsalz. Dann mit einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben, die vorsichtig gemischt wird, und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für die Bestimmung des Fluoreszenzsignals bereiten Sie zunächst 10 Millimolar-Stammlösungen von Siponimod in D M S O vor.Dann machen Sie eine serielle Verdünnung in H B S S-Puffer, der 25 Mikromolare Forskalin enthält, und stimulieren Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern verschiedener Konzentrationen dieser Agonistenlösung für 30 Minuten.
Als nächstes zählen Sie das Lumineszenzsignal in einem Mikrotiterplattenleser, indem Sie Lumineszenz für die Detektionsmethode auswählen. Endpunkt für Lesetyp und Lumineszenzfaser für Optiktyp in der zugehörigen Software. Stellen Sie außerdem die Optikverstärkung auf 255 ein.
Importieren Sie dann die erhaltenen Fluoreszenzsignalwerte in ein Tabellenkalkulationsprogramm und verarbeiten Sie die Daten mit der nichtlinearen Regressionskurve passen Dosis-Wirkungs-Funktion. Der S1PRS-GI-Komplex konnte erfolgreich durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden, die von der SDS-Seite verifiziert wurde. Darüber hinaus war das Elektronenmikroskopieprotokoll, das in dieser Studie befolgt wurde, wirksam bei der Unterscheidung zwischen S1PRSGI-Partikeln mit klaren und gut definierten 2D-Klassen und Partikeln schlechter Qualität.
Darüber hinaus konnte eine elektronenmikroskopische Karte von S1PR3 GI mit einer guten Auflösung durch kürzere Schalenkorrelation durch ungleichmäßige Verfeinerung erzeugt werden. Nach der Strukturanalyse wurden funktionelle Assays für S one P R three durch Transfektion von C H O K one Zellen mit Rezeptor- und Sensorplasmiden durchgeführt, die zeigten, dass das Rezeptorplasmid-Sensor-Plasmid-Verhältnis von eins zu drei optimale Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse waren jedoch bei insgesamt 2 93 Zellen weniger realistisch Bei dieser Verarbeitung ist die Wahl der Algorithmen im Partikelschnitt und im Abschnitt der 2D- und 3D-Klassifizierung wichtig für die Lösung der so MPS G-Proteinkomplexe, insbesondere für die Modellierung der Lecks und ECFS.
