这种高通量测定可用于观察道尔盲肠幼虫的稳健引力行为。与在培养皿上进行的测定相比,在远距离上观察到蠕虫行为。这提高了测定的灵敏度,并允许进行详细的数据分析。
研究趋重行为可以深入了解重力感觉在盲肠炎中是如何发生的,这与理解哺乳动物前庭系统有关。创建重力分析室,分离dauers并将蠕虫注射到室中需要练习。您可以通过提前一天隔离dauers并创建腔室来节省时间。
首先设置一个本生燃烧器、一到两个剃须刀片、钳子、镊子、塑料切割表面和通风橱。要形成一个腔室,收集两个 5 毫升血清移液器,并用镊子从一个移液器上取下棉塞。用钳子将剃须刀片放在本生燃烧器上,直到变热。
使用加热刀片切掉第二个移液器的锥形端,使整个移液器具有均匀的直径。现在,快速将两个改进的移液器末端靠近火焰并稍微融化它们。通过将它们牢固地压在一起来连接这些末端,确保两个移液器的壁是连续的。
如果连接后有任何间隙可见,请将它们分开并重复此步骤。根据标准蠕虫程序用4%琼脂制备NGM,并在琼脂仍熔融时将其连接到血清移液器上来填充每个腔室。为了尽量减少由于冷却不均匀而导致琼脂稠度的任何变化,请在吸取琼脂时将移液器与工作台平行。
然后慢慢抽取溶液并用封口膜密封吸头,然后从移液器中取出腔室。将腔室平放冷却,让琼脂变硬后再移动。冷却后,将三毫米的六角扳手加热到本生燃烧器上,并通过将其牢固地压入中线一侧约五毫米的每个腔室的壁上来创建一个小塑料开口。
接下来,使用加热刀片去除腔室的棉花和锥形端部,并用石蜡膜密封末端。在实验前10至15天,将每种菌株与OP50细菌一起分块到两到三个大的NGM板上,并包裹石蜡膜。通过用M9缓冲液冲洗盖子和板并将溶液移液到15毫升离心管中来收集蠕虫。
通过在室温下以 1600 x G 旋转 30 至 60 秒来沉淀蠕虫,并用移液管或真空吸液器吸出大部分 M9 缓冲液。在每个蠕虫颗粒中加入7毫升1%十二烷基硫酸钠溶液,并将蠕虫留在其中30分钟。为了允许曝气,在此期间保持连续旋转管子。
然后,用M9冲洗三到五次,以除去洗涤剂。加入五毫升M9后,加入五毫升冷过滤的60%蔗糖溶液。充分混合,并在室温下以 1600 x G 离心五分钟以产生分离梯度。用两毫升M9缓冲液填充新的15毫升离心管。
现在压碎玻璃巴斯德移液器的末端以扩大孔。并使用这些移液器将溶液的顶层从蔗糖梯度转移到新管中。用 M9 缓冲液冲洗 dauers 三到五次。
在室温下以1600 x G 离心dauers五分钟,并用移液器或真空吸液器吸出大部分M9溶液。接下来,通过在解剖显微镜下手动计数三个单独的 1 微升液滴中的蠕虫数量来估计蠕虫密度,并使用这些计数的平均值来近似每微升的蠕虫数量。现在通过切割 10、20 或 200 微升移液器吸头的末端来加宽吸头孔。
将微量移液器的体积设置为略大于预期的吸液体积。吸出约1至2微升的浓蠕虫溶液,并允许少量空气进入尖端。轻轻地将移液器吸头推入琼脂中,同时按下微量移液器。
这将创建一个注射部位而不会堵塞尖端。将蠕虫释放到琼脂中,并使用石蜡膜密封开口。在室温下将腔室放置在深色法拉第笼内后,为了消除尽可能多的变量,标记每个腔室并将其垂直悬挂在法拉第笼内。
通过在相同的环境条件下平放一些腔室来同时测试水平控制。然后使用垂直定向的N2蠕虫作为阳性对照,使用含有N 2 dauers的水平定向室作为对实验菌株的额外阴性对照。几个小时后,dauer蠕虫开始从起始部位分散,需要几个小时才能到达腔室的两端。
在此期间,保持腔室不受干扰,并在注射后 12 至 24 小时内评分。接下来,一次移除一个腔室,并通过在解剖显微镜下寻找活的dauers并用墨水标记它们的位置来对重力进行评分。不要在注射部位两侧 2.5 厘米以内的蠕虫进行评分,因为这些蠕虫不太可能表现出定向偏好。
此外,避免对看似死亡或被困在液体中的蠕虫进行评分,并丢弃任何含有超过 50% 死亡或游泳蠕虫的腔室。为了量化结果,使用记号笔将腔室的每一半分成七个3.5厘米,从距离注射部位2.5厘米开始。使用手动计数计数器来统计每个部分中观察到的蠕虫数量。
在Briggsae盲肠中,大部分dauer蠕虫显示出向腔室顶部的迁移。然而,水平控制显示围绕腔室中心的分布,表明负重力行为。此外,布里格萨盲肠炎和秀丽隐杆线虫的垂直分布没有显示出任何差异,这表明布里格萨盲肠杆菌表现出类似于秀丽隐杆线虫道尔斯的负重症行为。
该方案不使用麻痹剂,例如叠氮化钠。因此,重要的是在将重力室从法拉第笼中取出后立即对其进行评分。该测定导致在秀丽隐杆线虫中发现了负的趋重行为。
通过测试几种突变菌株,它还揭示了蠕虫对妊娠的遗传和神经需求。