Questo test ad alto rendimento può essere utilizzato per osservare un robusto comportamento gravitattico nelle larve di caenorhabditis dauer. Il comportamento del verme è osservato su grandi distanze rispetto ai saggi eseguiti su una capsula di Petri. Ciò migliora la sensibilità del test e consente un'analisi dettagliata dei dati.
Lo studio del comportamento della gravitassi può fornire informazioni su come si verifica la sensazione di gravità nella caenorhabditis, che ha rilevanza per la comprensione del sistema vestibolare dei mammiferi. Creare le camere di analisi della gravitaxi, isolare i dauers e iniettare i vermi nelle camere richiede pratica. È possibile risparmiare tempo isolando i dauers e creando le camere con un giorno di anticipo.
Inizia installando un bruciatore Bunsen, una o due lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica e una cappa aspirante. Per creare una camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 millilitri e, con una pinzetta, rimuovere il tappo di cotone da una pipetta. Tenere una lametta usando una pinza sul bruciatore Bunsen fino a quando non è caldo.
Utilizzare la lama riscaldata per tagliare l'estremità conica della seconda pipetta in modo che l'intera pipetta abbia un diametro uniforme. Ora, avvicinare rapidamente le due estremità della pipetta modificate alla fiamma e scioglierle leggermente. Unire queste estremità premendole saldamente, assicurandosi che le pareti di entrambe le pipette siano continue.
Se sono visibili degli spazi vuoti dopo l'unione, spezzarli e ripetere questo passaggio. Preparare NGM con il 4% di agar secondo le procedure standard di verme e riempire ogni camera collegandola a un pipetter sierologico mentre l'agar è ancora fuso. Per ridurre al minimo eventuali variazioni nella consistenza dell'agar dovute a un raffreddamento non uniforme, tenere il pipetter parallelo al piano del banco mentre si disegna l'agar.
Quindi aspirare lentamente la soluzione e sigillare la punta con parafilm prima di rimuovere la camera dal pipetter. Appoggiare la camera piatta per raffreddare e lasciare che l'agar si indurisca prima di muoversi. Una volta raffreddato, riscaldare una chiave esagonale da tre millimetri su un bruciatore Bunsen e creare una piccola apertura di plastica premendola saldamente nella parete di ciascuna camera a circa cinque millimetri da un lato della linea mediana.
Quindi, utilizzare una lama riscaldata per rimuovere il cotone e le estremità affusolate della camera e sigillare le estremità con pellicola di paraffina. Da 10 a 15 giorni prima dell'esperimento, suddividere ogni ceppo su due o tre grandi piastre NGM con batteri OP50 e avvolgere il film di paraffina. Raccogliere i vermi sciacquando i coperchi e le piastre con M9 Buffer e pipettando la soluzione in provette da centrifuga da 15 millilitri.
Pellettare i vermi ruotando a 1600 x G per 30-60 secondi a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte del tampone M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Aggiungere sette millilitri di soluzione di dodecilsolfato di sodio all'1% a ciascun pellet di verme e lasciare i vermi in esso per 30 minuti. Per consentire l'aerazione, continuare a ruotare continuamente i tubi durante questo periodo.
Quindi, rimuovere il detergente risciacquandolo da tre a cinque volte con M9. Dopo aver aggiunto cinque millilitri di M9, aggiungere cinque millilitri di soluzione di saccarosio filtrata a freddo al 60%. Mescolare accuratamente e creare un gradiente di separazione centrifugando a 1600 x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Riempire nuovi tubi da centrifuga da 15 millilitri con due millilitri di M9 Buffer.
Ora schiacciare le estremità delle pipette Pasteur di vetro per allargare il foro. E utilizzare queste pipette per trasferire lo strato superiore della soluzione dal gradiente di saccarosio ai nuovi tubi. Risciacquare i dauers da tre a cinque volte con M9 Buffer.
Centrifugare a 1600 x G per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte della soluzione M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Quindi, stimare la densità dei vermi contando manualmente il numero di vermi in tre goccioline separate da 1 microlitro al microscopio da dissezione e utilizzare la media di questi conteggi per approssimare il numero di vermi per microlitro. Ora allargare il foro della punta tagliando l'estremità delle punte delle pipette da 10, 20 o 200 microlitri.
Impostare la micropipetta su un volume leggermente maggiore rispetto al volume di aspirazione previsto. Aspirare circa 1-2 microlitri della soluzione concentrata di vite senza fine e lasciare entrare una piccola quantità di aria nella punta. Spingere delicatamente la punta della pipetta nell'agar mentre si preme la micropipetta.
Questo creerà un sito di iniezione senza intasare la punta. Rilasciare i vermi nell'agar e utilizzare la pellicola di paraffina per sigillare l'apertura. Per eliminare il maggior numero possibile di variabili una volta che le camere sono posizionate all'interno di una gabbia di Faraday buia a temperatura ambiente, etichettare ogni camera e appenderla verticalmente all'interno della gabbia di Faraday.
Testare i controlli orizzontali contemporaneamente posizionando alcune camere piatte nelle stesse condizioni ambientali. Quindi utilizzare i vermi N2 orientati verticalmente come controllo positivo e le camere orientate orizzontalmente contenenti Dauers N2 come ulteriore controllo negativo contro i ceppi sperimentali. Dopo alcune ore, i vermi dauer iniziano a disperdersi dal sito di partenza e impiegano diverse ore per raggiungere entrambe le estremità della camera.
Lasciare le camere indisturbate durante questo periodo e segnare entro 12-24 ore dopo l'iniezione. Quindi, rimuovere le camere una alla volta e valutare i gravitassi cercando i dauers vivi al microscopio da dissezione e contrassegnando le loro posizioni con l'inchiostro. Non segnare i vermi entro 2,5 centimetri da entrambi i lati del sito di iniezione poiché è improbabile che questi vermi dimostrino una preferenza direzionale.
Inoltre, evitare di segnare vermi che sembrano morti o intrappolati nel liquido e scartare tutte le camere contenenti più del 50% di vermi morti o nuotatori. Per quantificare i risultati, utilizzare un marcatore per dividere ciascuna metà della camera in sette 3,5 centimetri, a partire da 2,5 centimetri di distanza dal sito di iniezione. Utilizzare un contatore di conteggio manuale per calcolare il numero di worm osservati in ogni sezione.
In caenorhabditis briggsae, una grande percentuale di vermi dauer ha mostrato una migrazione verso la parte superiore delle camere. Tuttavia, i controlli orizzontali hanno mostrato una distribuzione attorno al centro delle camere, indicando un comportamento gravitattico negativo. Inoltre, le distribuzioni verticali di caenorhabditis briggsae e caenorhabditis elegans non hanno mostrato alcuna differenza, suggerendo che i caenorhabditis briggsae dauers mostrino un comportamento gravitasico negativo simile a quello di caenorhabditis elegans dauers.
Gli agenti paralitici come l'azoturo di sodio non sono utilizzati in questo protocollo. Pertanto, è importante segnare le camere gravitassi non appena vengono rimosse dalla gabbia di Faraday. Questo test ha portato alla scoperta del comportamento gravitazionale negativo nei c.elegans.
Attraverso il test di diversi ceppi mutanti, ha anche rivelato requisiti genetici e neurali per la gravitassi nei vermi.
