يمكن استخدام هذا الفحص عالي الإنتاجية لمراقبة سلوك الجاذبية القوي في يرقات caenorhabditis dauer. لوحظ سلوك الدودة على مسافات كبيرة مقارنة بالفحوصات التي أجريت على طبق بتري. هذا يعزز حساسية الفحص ويسمح بتحليل البيانات التفصيلية.
يمكن أن توفر دراسة سلوك محور الجاذبية نظرة ثاقبة حول كيفية حدوث الإحساس بالجاذبية في التهاب كاينورهابديتيس ، والذي له صلة بفهم النظام الدهليزي للثدييات. يتطلب إنشاء غرف فحص محور الجاذبية ، وعزل الداورز ، وحقن الديدان في الغرف ممارسة. يمكنك توفير الوقت عن طريق عزل dauers وإنشاء الغرف قبل يوم واحد.
ابدأ بإعداد موقد بنسن ، وشفرة حلاقة واحدة إلى شفرتين ، وكماشة ، وملاقط ، وسطح قطع بلاستيكي ، وغطاء دخان. لإنشاء غرفة ، اجمع ماصتين مصليتين سعة 5 ملليلتر ، ومع ملاقط ، قم بإزالة قابس القطن من ماصة واحدة. أمسك شفرة حلاقة باستخدام كماشة فوق موقد بنسن حتى يسخن.
استخدم الشفرة المسخنة لتقطيع الطرف المدبب من الماصة الثانية بحيث يكون للماصة بأكملها قطر موحد. الآن ، بسرعة جلب اثنين من نهايات ماصة معدلة بالقرب من اللهب وتذوب لهم قليلا. انضم إلى هذه النهايات عن طريق الضغط عليها معا بإحكام ، مما يضمن استمرار جدران كلا الماصتين.
إذا كانت هناك أي فجوات مرئية بعد الانضمام ، فقم بتقسيمها وكرر هذه الخطوة. تحضير NGM مع 4٪ أجار وفقا لإجراءات الدودة القياسية وملء كل غرفة عن طريق إرفاقها بماصة مصلية بينما لا يزال الأجار منصهرا. لتقليل أي اختلافات في اتساق الأجار بسبب التبريد غير المتساوي ، أمسك الماصة بالتوازي مع سطح المقعد أثناء إعداد الأجار.
ثم ارسم المحلول ببطء وأغلق الطرف باستخدام parafilm قبل إزالة الغرفة من جهاز السحب. ضع الغرفة بشكل مسطح لتبرد واترك الأجار يتصلب قبل التحرك. بمجرد تبريده ، قم بتسخين مفتاح سداسي عشري بطول ثلاثة ملليمترات فوق موقد بنسن وإنشاء فتحة بلاستيكية صغيرة عن طريق الضغط عليه بقوة في جدار كل غرفة حوالي خمسة ملليمترات إلى جانب واحد من خط الوسط.
بعد ذلك ، استخدم شفرة ساخنة لإزالة القطن والنهايات المدببة للغرفة وختم النهايات بفيلم البارافين. قبل 10 إلى 15 يوما من التجربة ، قم بتقطيع كل سلالة على لوحين إلى ثلاثة ألواح NGM كبيرة مع بكتيريا OP50 ولف فيلم البارافين. جمع الديدان عن طريق شطف الأغطية والألواح باستخدام M9 Buffer وسحب المحلول إلى أنابيب طرد مركزي 15 ملليلتر.
قم بتكوير الديدان عن طريق الدوران بسرعة 1600 × G لمدة 30 إلى 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة وشفط معظم M9 Buffer باستخدام ماصة أو شفاط فراغ. أضف سبعة ملليلترات من محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ إلى كل حبيبة دودة واترك الديدان فيها لمدة 30 دقيقة. للسماح بالتهوية ، استمر في تدوير الأنابيب باستمرار خلال هذا الوقت.
ثم قم بإزالة المنظف عن طريق شطفه ثلاث إلى خمس مرات باستخدام M9. بعد إضافة خمسة ملليلترات M9 ، أضف خمسة ملليلترات من محلول السكروز المصفى على البارد بنسبة 60٪. اخلطي جيدا واصنعي تدرج فصل عن طريق الطرد المركزي عند 1600 × G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. املأ أنابيب الطرد المركزي الجديدة سعة 15 ملليلتر بملليلترين من M9 Buffer.
الآن سحق نهايات ماصات باستور الزجاجية لتوسيع التجويف. واستخدم هذه الماصات لنقل الطبقة العليا من المحلول من تدرج السكروز إلى الأنابيب الجديدة. اشطف الداورز ثلاث إلى خمس مرات باستخدام M9 Buffer.
تعمل أجهزة الطرد المركزي على 1600 × G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتستنشق معظم محلول M9 باستخدام ماصة أو شفاط فراغ. بعد ذلك ، قم بتقدير كثافة الدودة عن طريق حساب عدد الديدان يدويا في ثلاث قطرات منفصلة من 1 ميكرولتر تحت مجهر تشريح ، واستخدم متوسط هذه الأعداد لتقريب عدد الديدان لكل ميكرولتر. الآن قم بتوسيع تجويف الطرف عن طريق قطع نهاية أطراف ماصة 10 أو 20 أو 200 ميكرولتر.
اضبط الماصة الدقيقة على حجم أكبر قليلا من حجم الطموح المقصود. استنشاق ما يقرب من 1 إلى 2 ميكرولتر من محلول الدودة المركزة والسماح لكمية صغيرة من الهواء بدخول الطرف. ادفع طرف الماصة برفق إلى الآجار مع تثبيط الماصة الصغيرة.
سيؤدي ذلك إلى إنشاء موقع حقن دون انسداد الطرف. أطلق الديدان في الأجار واستخدم فيلم البارافين لإغلاق الفتحة. للقضاء على أكبر عدد ممكن من المتغيرات بمجرد وضع الغرف داخل قفص فاراداي مظلم في درجة حرارة الغرفة ، قم بتسمية كل غرفة وتعليقها عموديا داخل قفص فاراداي .
اختبر الضوابط الأفقية في وقت واحد عن طريق وضع بعض الغرف مسطحة داخل نفس الظروف البيئية. ثم استخدم ديدان N2 الموجهة رأسيا كعنصر تحكم إيجابي وغرف موجهة أفقيا تحتوي على Dauers N2 كعنصر تحكم سلبي إضافي ضد السلالات التجريبية. بعد بضع ساعات ، تبدأ ديدان dauer في التشتت من موقع البداية وتستغرق عدة ساعات للوصول إلى طرفي الغرفة.
اترك الغرف دون إزعاج خلال هذا الوقت وسجل في غضون 12 إلى 24 ساعة بعد الحقن. بعد ذلك ، قم بإزالة الغرف واحدة تلو الأخرى وسجل محور الجاذبية من خلال البحث عن dauers الحية تحت مجهر تشريح ووضع علامات على مواقعها بالحبر. لا تسجل الديدان في حدود 2.5 سم على جانبي موقع الحقن لأن هذه الديدان من غير المحتمل أن تظهر تفضيلا اتجاهيا.
أيضا ، تجنب تسجيل الديدان التي تبدو ميتة أو محاصرة في السائل وتخلص من أي غرف تحتوي على أكثر من 50٪ من الديدان الميتة أو السباحة. لتحديد النتائج كميا، استخدم علامة لتقسيم كل نصف من الغرفة إلى سبعة 3.5 سم، بدءا من 2.5 سم بعيدا عن موقع الحقن. استخدم عداد إحصاء يدوي لإحصاء عدد الديدان التي لوحظت في كل قسم.
في caenorhabditis briggsae ، أظهرت نسبة كبيرة من ديدان داوير هجرة نحو الجزء العلوي من الغرف. ومع ذلك ، أظهرت الضوابط الأفقية توزيعا حول مركز الغرف ، مما يشير إلى سلوك الجاذبية السلبي. أيضا ، لم تظهر التوزيعات الرأسية ل caenorhabditis briggsae و caenorhabditis elegans أي فرق مما يشير إلى أن caenorhabditis briggsae dauers تظهر سلوكا سلبيا لمحور الجاذبية مشابها ل caenorhabditis elegans dauers.
لا تستخدم العوامل المشلولة مثل أزيد الصوديوم في هذا البروتوكول. لذلك ، من المهم تسجيل غرف محور الجاذبية بمجرد إزالتها من قفص فاراداي. أدى هذا الفحص إلى اكتشاف سلوك محور الجاذبية السلبي في c.elegans.
من خلال اختبار العديد من السلالات الطافرة ، كشفت أيضا عن المتطلبات الوراثية والعصبية لمحور الجاذبية في الديدان.
