このハイスループットアッセイは、カエノラブディティス・ダウアー幼虫の堅牢な重量行動を観察するために使用できます。ワームの挙動は、シャーレで行われたアッセイと比較して、長距離にわたって観察されます。これにより、アッセイの感度が向上し、詳細なデータ分析が可能になります。
重力作用を研究することで、盲腸炎で重力感覚がどのように発生するかについての洞察が得られ、哺乳類の前庭系を理解するのに役立ちます。グラビタキシスアッセイチャンバーの作成、ダウアーの分離、チャンバーへのワームの注入には練習が必要です。ダウアーを隔離し、前日にチャンバーを作成することで時間を節約できます。
ブンゼンバーナー、1〜2個のかみそりの刃、ペンチ、ピンセット、プラスチック製の切断面、およびドラフトを設置することから始めます。チャンバーを作るには、2つの5ミリリットルの血清学的ピペットを集め、ピンセットで1つのピペットから綿プラグを取り外します。ペンチを使用してかみそりの刃をブンゼンバーナーの上に熱くなるまで保持します。
加熱されたブレードを使用して、ピペット全体の直径が均一になるように、2番目のピペットのテーパー端を切り取ります。次に、2つの変更されたピペットの端をすばやく炎に近づけ、わずかに溶かします。両端をしっかりと押し合わせて接合し、両方のピペットの壁が連続していることを確認します。
結合後にギャップが見える場合は、それらを分解してこの手順を繰り返します。標準的なワーム手順に従って4%寒天でNGMを調製し、寒天がまだ溶けている間に血清学的ピペッターに取り付けて各チャンバーを満たします。不均一な冷却による寒天の粘稠度の変動を最小限に抑えるために、寒天を引き上げながらピペッターをベンチトップと平行に保持します。
次に、溶液をゆっくりと吸引し、チップをパラフィルムで密封してから、チャンバーをピペッターから取り出します。チャンバーを平らに置いて冷却し、寒天を硬化させてから移動します。冷却したら、ブンゼンバーナーで3ミリメートルの六角レンチを加熱し、正中線の片側に約5ミリメートルの各チャンバーの壁にしっかりと押し込んで小さなプラスチック開口部を作成します。
次に、加熱されたブレードを使用して、チャンバーの綿と先細りの端を取り除き、端をパラフィンフィルムで密封します。実験の10〜15日前に、各菌株をOP50細菌を含む2〜3個の大きなNGMプレートにチャンクし、パラフィンフィルムを包みます。蓋とプレートをM9バッファーですすぎ、溶液を15ミリリットルの遠沈管にピペッティングして、ワームを収集します。
1600 x Gで室温で30〜60秒間回転させてワームをペレット化し、ピペットまたは真空アスピレーターでM9バッファーの大部分を吸引します。各ワームペレットに7ミリリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加え、その中にワームを30分間放置します。曝気を可能にするために、この間チューブを継続的に回転させ続けます。
次に、洗剤をM9で3〜5回すすいで取り除きます。5ミリリットルのM9を加えた後、5ミリリットルの冷濾過された60%スクロース溶液を加える。十分に混合し、室温で1600 x Gで5分間遠心分離することにより、分離勾配を作成します。新しい15ミリリットルの遠心分離機チューブに2ミリリットルのM9バッファーを充填します。
次に、ガラスパスツールピペットの端をつぶして、穴を広げます。そして、これらのピペットを使用して、溶液の最上層をスクロース勾配から新しいチューブに移します。M9バッファーでダウアーを3〜5回すすぎます。
1600 x Gの遠心分離機で室温で5分間遠心分離し、ピペットまたは真空アスピレーターでM9溶液の大部分を吸引します。次に、解剖顕微鏡下で3つの別々の1マイクロリットルの液滴中のワームの数を手動でカウントすることによってワーム密度を推定し、これらのカウントの平均を使用してマイクロリットルあたりのワームの数を概算します。次に、10、20、または200マイクロリットルのピペットチップの端を切断して、チップボアを広げます。
マイクロピペットを意図した吸引量よりわずかに大きい容量に設定します。約1〜2マイクロリットルの濃縮ワーム溶液を吸引し、少量の空気が先端に入るようにします。マイクロピペットを押し下げながら、ピペットチップを寒天にそっと押し込みます。
これにより、先端を詰まらせることなく注射部位が作成されます。ワームを寒天に放出し、パラフィンフィルムを使用して開口部を密閉します。チャンバーが室温の暗いファラデーケージ内に置かれた後、できるだけ多くの変数を排除するには、各チャンバーにラベルを付け、ファラデーケージ内で垂直に吊るします。
同じ環境条件内でいくつかのチャンバーを平らに置くことにより、水平制御を同時にテストします。次に、垂直方向のN2ワームをポジティブコントロールとして使用し、N2ダウアーを含む水平方向のチャンバーを実験株に対する追加のネガティブコントロールとして使用します。数時間後、ダウアーワームは開始場所から分散し始め、チャンバーの両端に到達するまでに数時間かかります。
この間、チャンバーを邪魔せずに放置し、注射後12〜24時間以内にスコアを付けます。次に、チャンバーを一度に1つずつ取り外し、解剖顕微鏡で生きているダウアーを探し、その場所にインクで印を付けて、重力タクシーをスコアリングします。注射部位の両側から2.5センチメートル以内のワームは、方向の好みを示している可能性が低いため、スコアを付けないでください。
また、死んでいるように見えるワームや液体に閉じ込められているワームのスコアリングを避け、50%を超える死んだワームや泳いでいるワームを含むチャンバーは廃棄してください。結果を定量化するには、マーカーを使用して、チャンバーの各半分を注射部位から2.5センチメートル離れたところから始めて、7つの3.5センチメートルに分割します。手動集計カウンターを使用して、各セクションで観察されたワームの数を集計します。
カエノラブディティス・ブリッグサエでは、ダウアーワームの大部分がチャンバーの上部に向かって移動を示しました。しかし、水平コントロールはチャンバーの中心付近に分布を示し、負の重力挙動を示しました。また、カエノラブディティス・ブリグサエとカエノラブディティス・エレガンスの鉛直分布は差を示さず、カエノラブディティス・ブリグサエ・ダウアーはカエノラブディティス・エレガンス・ダウアーと同様の負の重力作用を示すことが示唆された。
アジ化ナトリウムなどの麻痺剤は、このプロトコルでは使用されません。したがって、重力槽がファラデーケージから取り外されたらすぐにスコアを付けることが重要です。このアッセイは、c.elegansにおける負の重力作用の発見につながりました。
いくつかの変異株をテストすることにより、ワームのグラビタキシスの遺伝的および神経的要件も明らかにしました。
