Este ensaio de alto rendimento pode ser usado para observar um comportamento gracástico robusto em larvas de caenorhabditis dauer. O comportamento do verme é observado em grandes distâncias em comparação com ensaios realizados em uma placa de petri. Isso aumenta a sensibilidade do ensaio e permite uma análise detalhada dos dados.
Estudar o comportamento da gravitaxis pode fornecer uma visão de como a sensação da gravidade ocorre na caenorhabdite, que tem relevância para a compreensão do sistema vestibular de mamíferos. Criar as câmaras de ensaio gravitaxis, isolar os promotores e injetar os vermes nas câmaras requer prática. Você pode economizar tempo isolando os dauers e criando as câmaras com um dia de antecedência.
Comece montando um queimador Bunsen, uma a duas lâminas de barbear, alicate, pinças e uma superfície de corte de plástico, e um capô de fumaça. Para fazer uma câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mililitros, e com pinças, retire o plugue de algodão de uma pipeta. Segure uma lâmina de barbear usando alicate sobre o queimador Bunsen até ficar quente.
Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro uniforme. Agora, leve rapidamente as duas extremidades modificadas de pipeta perto da chama e derreta-as ligeiramente. Junte essas extremidades pressionando-as firmemente, garantindo que as paredes de ambas as pipetas sejam contínuas.
Se alguma lacuna for visível após a adesão, separe-as e repita esta etapa. Prepare o NGM com 4% de ágar de acordo com os procedimentos padrão de vermes e encha cada câmara anexando-o a uma pipetter sorológica enquanto o ágar ainda está derretido. Para minimizar quaisquer variações na consistência do ágar devido ao resfriamento irregular, segure a pipeta paralela à parte superior do banco enquanto elabora o ágar.
Em seguida, desenhe lentamente a solução e sele a ponta com parafilme antes de remover a câmara da pipeta. Coloque a câmara plana para esfriar e deixe o ágar endurecer antes de se mover. Uma vez resfriado, aqueça uma chave de hex de três milímetros sobre um queimador de Bunsen e crie uma pequena abertura de plástico pressionando-a firmemente na parede de cada câmara cerca de cinco milímetros para um lado da linha média.
Em seguida, use uma lâmina aquecida para remover o algodão e extremidades afiladas da câmara e selar as extremidades com filme de parafina. 10 a 15 dias antes do experimento, empeque cada tensão em duas a três grandes placas de NGM com bactérias OP50 e enrole o filme de parafina. Colete vermes enxaguando as tampas e placas com tampão M9 e pipetando a solução em tubos de centrífugas de 15 mililitros.
Pelota os vermes girando a 1600 x G por 30 a 60 segundos em temperatura ambiente e aspire a maior parte do Tampão M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo. Adicione sete mililitros de 1% de sulfato de dodecyl de sódio a cada pelota de verme e deixe os vermes nele por 30 minutos. Para permitir a aeração, continue girando os tubos continuamente durante este tempo.
Em seguida, remova o detergente enxaguando-o três a cinco vezes com M9. Depois de adicionar cinco mililitros M9, adicione cinco mililitros de solução de sacarose filtrada a frio de 60%. Misture bem e crie um gradiente de separação centrifugando a 1600 x G por cinco minutos à temperatura ambiente. Encha novos tubos de centrífugas de 15 mililitros com dois mililitros de Tampão M9.
Agora esmague as pontas das pipetas pasteur de vidro para ampliar o furo. E use essas pipetas para transferir a camada superior da solução do gradiente de sacarose para os novos tubos. Enxágüe os dauers três a cinco vezes com M9 Buffer.
Dauers centrífugas a 1600 x G por cinco minutos à temperatura ambiente e aspiram a maior parte da solução M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo. Em seguida, estime a densidade de vermes contando manualmente o número de vermes em três gotículas 1-microliter separadas sob um microscópio dissecando, e use a média dessas contagens para aproximar o número de vermes por microliter. Agora amplie o furo de ponta cortando o final de 10, 20 ou 200 dicas de pipeta de 200 microliter.
Ajuste a micropipette em um volume ligeiramente maior do que o volume de aspiração pretendido. Aspire aproximadamente 1 a 2 microliters da solução concentrada de vermes e permita que uma pequena quantidade de ar entre na ponta. Empurre suavemente a ponta da pipeta para dentro do ágar enquanto deprimi a micro pipeta.
Isso criará um site de injeção sem entupir a ponta. Solte os vermes no ágar e use o filme de parafina para selar a abertura. Para eliminar o maior número possível de variáveis, uma vez que as câmaras são colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday à temperatura ambiente, rotule cada câmara e pendure-a verticalmente dentro da gaiola de Faraday.
Teste controles horizontais simultaneamente colocando algumas câmaras planas dentro das mesmas condições ambientais. Em seguida, use os worms N2 orientados verticalmente como um controle positivo e câmaras orientadas horizontalmente contendo dauers N2 como um controle negativo adicional contra as cepas experimentais. Depois de algumas horas, os vermes dauer começam a se dispersar do local de partida e levam várias horas para chegar a ambos os lados da câmara.
Deixe as câmaras intactas durante este período e marque dentro de 12 a 24 horas após a injeção. Em seguida, remova as câmaras uma de cada vez e marque gravitaxis procurando dauers vivos sob um microscópio dissecando e marcando suas localizações com tinta. Não marque vermes dentro de 2,5 centímetros para ambos os lados do local de injeção, pois esses vermes não estão demonstrando uma preferência direcional.
Além disso, evite marcar vermes que pareçam mortos ou estão presos no líquido e descarte quaisquer câmaras contendo mais de 50% de vermes mortos ou nadando. Para quantificar os resultados, use um marcador para dividir cada metade da câmara em sete centímetros e 3,5 centímetros, a partir de 2,5 centímetros do local da injeção. Use um contador de contagem manual para contabilizar o número de worms observados em cada seção.
Na caenorhabditis briggsae, uma grande porcentagem de vermes dauer mostrou migração para o topo das câmaras. No entanto, os controles horizontais mostraram distribuição ao redor do centro das câmaras, indicando comportamento gravitativo negativo. Além disso, as distribuições verticais de caenorhabditis briggsae e caenorhabditis elegans não mostraram qualquer diferença sugerindo que caenorhabditis briggsae dauers mostram um comportamento gravitaxis negativo semelhante ao caenorhabditis elegans dauers.
Agentes paralíticos como o azida de sódio não são usados neste protocolo. Portanto, é importante pontuar as câmaras gravitacionais assim que forem removidas da jaula de Faraday. Este ensaio levou à descoberta de um comportamento gravitaxis negativo em c.elegans.
Através do teste de várias cepas mutantes, também revelou requisitos genéticos e neurais para gravitaxis em vermes.
