Mit diesem Hochdurchsatz-Assay kann ein robustes gravitaktisches Verhalten in Caenorhabditis dauerlarven beobachtet werden. Das Verhalten von Würmern wird über große Entfernungen beobachtet, verglichen mit Assays, die an einer Petrischale durchgeführt werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Assays und ermöglicht eine detaillierte Datenanalyse.
Die Untersuchung des Gravitaxisverhaltens kann Aufschluss darüber geben, wie die Schwerkraftempfindung bei Caenorhabditis auftritt, was für das Verständnis des vestibulären Systems von Säugetieren relevant ist. Das Erstellen der Gravitaxis-Assay-Kammern, das Isolieren von Dauers und das Injizieren der Würmer in die Kammern erfordert Übung. Sie können Zeit sparen, indem Sie die Behälter isolieren und die Kammern einen Tag im Voraus erstellen.
Beginnen Sie mit der Einrichtung eines Bunsenbrenners, ein bis zwei Rasierklingen, einer Zange, einer Pinzette und einer Kunststoffschneidefläche sowie einer Abzugshaube. Um eine Kammer zu bilden, sammeln Sie zwei serologische 5-Milliliter-Pipetten und entfernen Sie mit einer Pinzette den Baumwollpfropfen von einer Pipette. Halten Sie eine Rasierklinge mit einer Zange über den Bunsenbrenner, bis sie heiß ist.
Verwenden Sie die beheizte Klinge, um das konische Ende der zweiten Pipette abzuschneiden, so dass die gesamte Pipette einen einheitlichen Durchmesser hat. Bringen Sie nun die beiden modifizierten Pipettenenden schnell in die Nähe der Flamme und schmelzen Sie sie leicht. Verbinden Sie diese Enden, indem Sie sie fest zusammendrücken, um sicherzustellen, dass die Wände beider Pipetten durchgehend sind.
Wenn nach dem Fügen Lücken sichtbar sind, brechen Sie diese auseinander und wiederholen Sie diesen Schritt. Bereiten Sie NGM mit 4% Agar nach Standard-Wurmverfahren vor und füllen Sie jede Kammer, indem Sie sie an einen serologischen Pipetter legen, während der Agar noch geschmolzen ist. Um Schwankungen in der Konsistenz des Agars aufgrund ungleichmäßiger Abkühlung zu minimieren, halten Sie den Pipter parallel zur Tischplatte, während Sie den Agar aufziehen.
Ziehen Sie dann langsam die Lösung und verschließen Sie die Spitze mit Parafilm, bevor Sie die Kammer aus dem Pipter entfernen. Legen Sie die Kammer flach, um abzukühlen, und lassen Sie den Agar aushärten, bevor Sie sich bewegen. Nach dem Abkühlen erhitzen Sie einen Drei-Millimeter-Inbusschlüssel über einem Bunsenbrenner und erzeugen Sie eine kleine Kunststofföffnung, indem Sie ihn fest in die Wand jeder Kammer drücken, etwa fünf Millimeter zu einer Seite der Mittellinie.
Als nächstes verwenden Sie eine beheizte Klinge, um die Baumwolle und die konischen Enden der Kammer zu entfernen und die Enden mit Paraffinfolie zu versiegeln. 10 bis 15 Tage vor dem Experiment jeden Stamm auf zwei bis drei große NGM-Platten mit OP50-Bakterien aufteilen und den Paraffinfilm einwickeln. Sammeln Sie Würmer, indem Sie die Deckel und Platten mit M9 Buffer spülen und die Lösung in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettieren.
Pelletieren Sie die Würmer, indem Sie sie bei 1600 x G für 30 bis 60 Sekunden bei Raumtemperatur drehen und den größten Teil des M9-Puffers mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger absaugen. Fügen Sie sieben Milliliter 1% Natriumdodecylsulfatlösung zu jedem Wurmpellet hinzu und lassen Sie die Würmer 30 Minuten darin stehen. Um eine Belüftung zu ermöglichen, drehen Sie die Rohre während dieser Zeit kontinuierlich.
Entfernen Sie dann das Reinigungsmittel, indem Sie es drei- bis fünfmal mit M9 abspülen. Nach Zugabe von fünf Milliliter M9 fügen Sie fünf Milliliter kaltgefilterte 60% ige Saccharoselösung hinzu. Mischen Sie gründlich und erzeugen Sie einen Trenngradienten durch Zentrifugieren bei 1600 x G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Füllen Sie neue 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit zwei Milliliter M9-Puffer.
Zerkleinern Sie nun die Enden der Pasteur-Pipetten aus Glas, um die Bohrung zu erweitern. Und verwenden Sie diese Pipetten, um die oberste Schicht der Lösung vom Saccharosegradienten auf die neuen Röhrchen zu übertragen. Spülen Sie die Dauern drei- bis fünfmal mit M9 Buffer ab.
Die Zentrifuge konzentriert sich fünf Minuten bei Raumtemperatur auf 1600 x G und saugt den größten Teil der M9-Lösung mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger ab. Als nächstes schätzen Sie die Wurmdichte, indem Sie die Anzahl der Würmer in drei separaten 1-Mikroliter-Tröpfchen unter einem Seziermikroskop manuell zählen und den Durchschnitt dieser Zählungen verwenden, um die Anzahl der Würmer pro Mikroliter anzunähern. Erweitern Sie nun die Spitzenbohrung, indem Sie das Ende von 10-, 20- oder 200-Mikroliter-Pipettenspitzen abschneiden.
Stellen Sie die Mikropipette auf ein etwas größeres Volumen als das vorgesehene Aspirationsvolumen ein. Saugen Sie etwa 1 bis 2 Mikroliter der konzentrierten Schneckenlösung ab und lassen Sie eine kleine Menge Luft in die Spitze eindringen. Drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig in den Agar, während Sie die Mikropipette drücken.
Dadurch entsteht eine Injektionsstelle, ohne die Spitze zu verstopfen. Lassen Sie die Würmer in den Agar und verwenden Sie Paraffinfolie, um die Öffnung zu versiegeln. Um so viele Variablen wie möglich zu eliminieren, sobald die Kammern in einem dunklen Faradayschen Käfig bei Raumtemperatur platziert sind, beschriften Sie jede Kammer und hängen Sie sie vertikal in den Faradayschen Käfig.
Testen Sie horizontale Steuerungen gleichzeitig, indem Sie einige Kammern flach unter den gleichen Umgebungsbedingungen verlegen. Verwenden Sie dann die vertikal orientierten N2-Würmer als Positivkontrolle und horizontal ausgerichtete Kammern mit N2-Dauern als zusätzliche Negativkontrolle gegen die experimentellen Stämme. Nach einigen Stunden beginnen sich die Dauerwürmer von der Startstelle aus zu zerstreuen und brauchen mehrere Stunden, um beide Enden der Kammer zu erreichen.
Lassen Sie die Kammern während dieser Zeit ungestört und erzielen Sie innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach der Injektion. Als nächstes entfernen Sie die Kammern nacheinander und bewerten die Gravitaxie, indem Sie unter einem Seziermikroskop nach lebenden Dauern suchen und ihre Positionen mit Tinte markieren. Schneiden Sie keine Würmer innerhalb von 2,5 Zentimetern zu beiden Seiten der Injektionsstelle, da diese Würmer wahrscheinlich keine Richtungspräferenz zeigen.
Vermeiden Sie auch das Sammeln von Würmern, die tot erscheinen oder in der Flüssigkeit gefangen sind, und werfen Sie alle Kammern weg, die mehr als 50% tote oder schwimmende Würmer enthalten. Um die Ergebnisse zu quantifizieren, verwenden Sie einen Marker, um jede Hälfte der Kammer in sieben 3,5 Zentimeter zu teilen, beginnend 2,5 Zentimeter von der Injektionsstelle entfernt. Verwenden Sie einen manuellen Zähler, um die Anzahl der in jedem Abschnitt beobachteten Würmer zu ermitteln.
Bei Caenorhabditis briggsae zeigte ein großer Prozentsatz der Dauerwürmer eine Migration in Richtung der Oberseite der Kammern. Die horizontalen Kontrollen zeigten jedoch eine Verteilung um die Mitte der Kammern, was auf ein negatives gravitaktisches Verhalten hindeutet. Auch die vertikalen Verteilungen von Caenorhabditis briggsae und Caenorhabditis elegans zeigten keinen Unterschied, was darauf hindeutet, dass Caenorhabditis briggsae dauers ein negatives Gravitaxisverhalten ähnlich wie Caenorhabditis elegans dauers zeigt.
Paralytika wie Natriumazid werden in diesem Protokoll nicht verwendet. Daher ist es wichtig, die Gravitaxiskammern zu ritzen, sobald sie aus dem Faradayschen Käfig entfernt werden. Dieser Assay führte zur Entdeckung eines negativen Gravitaxisverhaltens bei c.elegans.
Durch das Testen mehrerer mutierter Stämme wurden auch genetische und neuronale Anforderungen an die Gravitaxie bei Würmern aufgedeckt.
