该协议描述了如何选择可以区分感染性病毒和非感染性病毒的DNA适配体，以获得能够告知临床或环境样品可感染性的传感分子。该技术可用于获得许多其他病毒（包括新兴病毒）的选择性适配体，因为它不需要事先了解病毒的结构或序列。该技术允许开发用于传染性病毒的临床诊断和环境监测的适配体传感器，以检测某人是否具有传染性或环境消毒方法是否按预期工作。
选择可能是一个艰难的过程，特别是对于那些刚接触它的人来说。优化PCR条件并使用qPCR监测选择进度非常重要。演示该程序的将是我实验室的研究生Marcos Gramajo。
首先，设计初始单链或SS-DNA文库和引物。通过标准脱盐纯化从商业来源获得 DNA 寡核苷酸。在10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上纯化SS-DNA文库和引物，然后进行乙醇沉淀。
接下来，获得传染性和非传染性病毒的储备溶液，或按照文本手稿中的说明制备它们。对于SS-DNA文库的变性，将10微升100微摩尔SS-DNA文库与240微升SELEX缓冲液混合。在干浴中将混合物在 95 摄氏度下加热 15 分钟，然后将管子放在冰上 15 分钟。
将 SELEX 缓冲液中的 250 微升 SS-DNA 文库与 50 微升感染性病毒混合以进行正向选择。在室温下孵育两小时。然后将 400 微升的一毫摩尔 T20 序列添加到 0.5 毫升过滤器中以阻断非特异性位点。
将过滤器孵育 30 分钟。将过滤器以14， 000 G离心10分钟以除去T20溶液。然后用SELEX缓冲液清洗过滤器三次，以去除多余的T20序列。
接下来，将SS-DNA文库感染性病毒混合物添加到封闭的100千道尔顿过滤器中，并离心以洗涤未结合的序列。通过加入 400 微升 SELEX 缓冲液并离心来清洗过滤器三次。将馏分保留在过滤器中并丢弃流出物。
要洗脱结合序列，请更换离心机过滤器的收集管，并向过滤器中加入含有8摩尔尿素的300微升SELEX缓冲液。将过滤器在95摄氏度下加热15分钟，然后离心以收集含有洗脱序列的流出物。完成后，用10%漂白剂清洗材料。
接下来，将先前步骤中收集的SS-DNA感染性病毒溶液加入封闭的10千道尔顿过滤器中，以14， 000G离心15分钟并丢弃流出物。用 300 微升 SELEX 缓冲液清洗过滤器三次，通过离心除去尿素并丢弃流出物。通过在干净的收集管中将其倒置并离心五分钟来回收过滤器中的溶液。
使用移液管测量回收溶液的最终体积，并将其标记为1A轮样品。在第一轮中取 90% 的 1A 轮样品作为模板，并使用优化的条件运行 PCR。要使用链霉亲和素修饰的磁珠或MB回收SS-DNA，请将产品分成50微升等分试样，并将它们添加到含有50微升MB的微量离心管中。将试管在室温下温和搅拌孵育 30 分钟。
然后将试管放在磁性架上以分离MB并通过移液除去上清液。通过向管中加入 200 微升结合和洗涤缓冲液来洗涤 MB 两次。然后从磁性架上取下试管并敲击它，然后通过移液将 MB 重新悬浮到均匀的溶液中。
将试管再次放在磁性架上并除去上清液。第二次洗涤后，将MB重悬于100微升SELEX缓冲液中，并在95摄氏度下加热溶液10分钟。立即将试管放入磁性架中并收集含有SS-DNA池的上清液。
重复此恢复步骤，加入 50 微升 SELEX 缓冲液。测量回收馏分的最终体积并将其标记为第 1X 轮。对于SS-DNA池的变性，取60%的Round 1X样品并将其与50微升SELEX缓冲液混合。
在干浴中加热样品，然后将试管放在冰上15分钟。接下来，将SELEX缓冲液中的变性SS-DNA池与50微升每种病毒混合作为反选择步骤，并在室温下孵育一小时。在离心机过滤器中封闭非特异性位点后，将与病毒溶液一起孵育的变性SS-DNA池的混合物加入封闭的100千道尔顿过滤器中。
将过滤器以 14， 000 G 离心 10 分钟并收集流出物。取300微升馏分，与50微升感染性病毒混合，每毫升含有1亿拷贝。在室温下孵育两小时。
如文中所述制备标准qPCR预混液和纯化的SS-DNA文库稀释液。运行 qPCR 以确定阈值循环。运行后，使用标准曲线量化第 1A 轮和第 1X 轮中的 SS-DNA 量。
然后将洗脱率计算为结合的DNA量除以初始DNA量，并绘制洗脱产率与整数的关系图。最后，绘制不同轮次的熔化曲线。对于高通量测序，请选择适当的市售试剂盒。
准备多个代表高、中和低富集的选择轮次池，以及使用适配器中每个池的不同索引对的最终池。然后将准备好的最终文库发送到测序设施。对于测序分析，测序工具对序列进行了解复用。
使用命令行程序 Cutadapt 移除测序适配器和选择引物。然后使用 FASTX 工具包程序删除低质量序列。然后，使用反向文件的 FASTX-Toolkit FASTX_reverse_补码功能将反向序列文件与正向序列文件合并。
然后使用内置的CAT程序将文件合并为单个文件。使用 FASTAptamer 分析工具包分析不同选择池中的序列富集情况。首先，使用 FASTAptamer 计数和 FASTAptamer 群集函数将相似的序列分组到群集中。
接下来，使用 FASTAptamer 扩充函数获取有关序列和聚类富集的信息。从通过序列分析获得的富集信息中鉴定候选适配体序列。选择几个适配体序列并使用结合测定进行初步筛选。
在该分析中，qPCR用于监测传染性SARS-CoV-2特异性适配体的SELEX进展。洗脱产率最初随着每一轮SELEX的增加而增加，并在第八轮和第九轮趋于平稳。通过比较熔化曲线，观察到在77至79摄氏度的高熔化温度下从峰值偏移。
此外，在最后两轮中，观察到低熔点温度下的峰值。显示了在连续选择轮次中获得的测序SARS2 AR10的每百万读的相对丰度。SARS2 AR10的预测结构显示一个结构化的二级结构，其中包含可能参与识别病毒的茎环区域。
一旦获得适配体，它们就可以被整合到电光学器件（另一种类型的传感器）中，以开发门户和快速病毒检测测试，从而告知病毒传染性。我们设想可以获得针对病毒的不同变体或刻板型的适配体，从而可以快速监测对社会构成最大威胁的变体。
