פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור אפטמרים של DNA שיכולים להבחין בין וירוסים זיהומיים לעומת וירוסים לא זיהומיים על מנת לקבל מולקולת חישה המסוגלת ליידע את יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי להשיג aptamers סלקטיבי עבור וירוסים רבים אחרים, כולל וירוסים מתעוררים, כי זה לא דורש ידע מוקדם של מבנים או רצפים של הנגיף. טכניקה זו מאפשרת פיתוח חיישני אפטמר לאבחון קליני וניטור סביבתי של וירוסים זיהומיים כדי לזהות אם מישהו מדבק או אם שיטת חיטוי סביבתית פועלת כמתוכנן.
בחירה יכולה להיות תהליך קשה, במיוחד עבור אלה חדשים בו. חשוב לייעל את תנאי ה-PCR ולעקוב אחר התקדמות הבחירה באמצעות qPCR. מי שידגים את ההליך יהיה מרקוס גרמג'ו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, עצבו את ספריית ה-DNA החד-גדילית או SS-DNA הראשונית ואת הפריימרים. השג את אוליגוס הדנ"א ממקורות מסחריים עם טיהור התפלה סטנדרטי. טיהור ספריית SS-DNA ופריימרים על אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד 10% דנטורינג ואחריו משקעים אתנול.
לאחר מכן, להשיג פתרון מלאי של וירוסים זיהומיות ולא זיהומיות או להכין אותם כמתואר בכתב היד טקסט. עבור דנטורציה של ספריית SS-DNA, ערבבו 10 מיקרוליטרים של ספריית SS-DNA 100 מיקרומולרית עם 240 מיקרוליטר של מאגר SELEX. מחממים את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבטיה יבשה, ולאחר מכן מניחים את הצינור על קרח במשך 15 דקות.
ערבבו 250 מיקרוליטר של ספריית SS-DNA במאגר SELEX עם 50 מיקרוליטר של וירוס מדבק לברירה חיובית. דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של רצף T20 מילימולרי אחד למסנן 0.5 מיליליטר כדי לחסום את האתרים הלא ספציפיים.
דגרו על הפילטרים למשך 30 דקות. צנטריפוגה את המסנן ב 14, 000 G במשך 10 דקות כדי להסיר את פתרון T20. לאחר מכן שטפו את המסנן שלוש פעמים עם מאגר SELEX כדי להסיר רצפי T20 עודפים.
לאחר מכן, הוסף את תערובת הווירוסים הזיהומיים של ספריית SS-DNA למסנן 100 קילודלטון ולצנטריפוגה החסומים כדי לשטוף רצפים לא קשורים. שטפו את המסנן שלוש פעמים על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של חיץ SELEX וצנטריפוגה. שמור את השבר במסנן והשמט את הזרימה.
כדי לשלול רצפים קשורים, שנה את צינור האיסוף של מסנן הצנטריפוגות והוסף 300 מיקרוליטר של חיץ SELEX המכיל שמונה אוריאה טוחנת למסנן. חממו את המסנן בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה כדי לאסוף את הזרימה המכילה את הרצפים המדוללים. לאחר שתסיים, שטפו את החומרים עם 10% אקונומיקה.
לאחר מכן, הוסף את תמיסת הנגיף הזיהומי SS-DNA שנאספה בשלב הקודם למסנן חסום של 10 קילודלתון, צנטריפוגה ב -14, 000 גרם למשך 15 דקות והשליך את הזרימה. שטפו את המסנן שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר של חיץ SELEX כדי להסיר את האוריאה בצנטריפוגה ולהשליך את הזרימה. לשחזר את הפתרון במסנן על ידי הפיכתו בצינור איסוף נקי צנטריפוגה במשך חמש דקות.
מדוד את הנפח הסופי של התמיסה המשוחזרת באמצעות פיפטה ותייג אותה כמדגם עגול 1A. קח 90% ממדגם סבב 1A כתבנית בסבב הראשון והפעל את ה- PCR בתנאים אופטימליים. כדי לשחזר SS-DNA באמצעות streptavidin שונה חרוזים מגנטיים או MB, לפצל את המוצר 50 aliquots מיקרוליטר ולהוסיף אותם צינורות microcentrifuge המכילים 50 מיקרוליטר MB. לדגור על הצינור במשך 30 דקות עם תסיסה קלה בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הניחו את הצינור על המדף המגנטי כדי לבודד את ה-MB והסירו את הסופרנאטנט על ידי פיפטציה. שטפו את ה-MB פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חיץ קשירה ושטיפה לצינור. לאחר מכן הסר את הצינור מהמדף המגנטי והקש עליו לפני שתשהה מחדש את ה- MB לתמיסה הומוגנית על ידי פיפטציה.
הניחו את הצינור שוב על המדף המגנטי והוציאו את הסופרנטנט. לאחר השטיפה השנייה, להשעות מחדש את MB ב 100 מיקרוליטר של מאגר SELEX ולחמם את התמיסה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור במדף המגנטי ואספו את הסופרנאטנט המכיל את מאגר ה-SS-DNA.
חזור על שלב התאוששות זה והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר SELEX. מדוד את הנפח הסופי של החלק המשוחזר ותייג אותו כ- Round 1X. עבור דנטורציה של מאגר SS-DNA, לקחת 60% של דגימת Round 1X ולערבב אותו עם 50 מיקרוליטר של מאגר SELEX.
מחממים את הדגימה באמבטיה יבשה, ואז מניחים את הצינור על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, ערבבו את מאגר הדנ"א SS-DNA מפורק במאגר SELEX עם 50 מיקרוליטר של כל וירוס כשלב הבחירה הנגדית ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר חסימת האתרים הלא ספציפיים במסנני צנטריפוגות, הוסיפו את מאגר SS-DNA מפורק המודגר בתמיסת וירוסים למסנן חסום של 100 קילודלטון.
צנטריפוגה את המסנן ב 14, 000 G במשך 10 דקות ולאסוף את הזרימה דרך. קח 300 מיקרוליטר של שבר וערבב עם 50 מיקרוליטר של וירוס זיהומיות המכיל 100 מיליון עותקים למיליליטר. דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
הכינו תערובת מאסטר סטנדרטית של qPCR ודילול של ספריית SS-DNA מטוהרת כמתואר בטקסט. הפעל את ה- qPCR כדי לקבוע את מחזור הסף. לאחר הריצה, השתמש בעקומה סטנדרטית כדי לכמת את כמות SS-DNA בסבב 1A ובסיבוב 1X.
לאחר מכן חשב את תפוקת האלוציה ככמות הדנ"א המאוגדת חלקי כמות הדנ"א הראשונית והתווה את תפוקת האלוציה לעומת המספר העגול. לבסוף, שרטט את עקומות ההיתוך לסבבים שונים. לריצוף בתפוקה גבוהה, בחר ערכה מתאימה הזמינה מסחרית.
הכינו מאגרים מרובים של סבבי בחירה המייצגים העשרה גבוהה, בינונית ונמוכה, וכן את המאגר הסופי באמצעות זוג אינדקסים שונים במתאמים לכל מאגר. לאחר מכן שלח את הספרייה הסופית שהוכנה למתקן הרצף. לצורך ניתוח ריצוף, הרצפים בוטלו על ידי מתקן הריצוף.
הסר את מתאמי הרצף ואת פריימרים הבחירה באמצעות תוכנית שורת הפקודה Cutadapt. לאחר מכן השתמש בתוכנית FASTX-Toolkit כדי להסיר רצפים באיכות נמוכה. לאחר מכן מזג את קובצי הרצף בכיוון ההפוך עם קובצי הכיוון קדימה באמצעות הפונקציה FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ משלימה בקובצי הכיוון ההפוך.
לאחר מכן השתמש בתוכנית CAT המובנית כדי למזג את הקבצים לקובץ יחיד. השתמש בערכת הכלים לניתוח FASTAptamer כדי לנתח את העשרת הרצפים במאגרי בחירה שונים. תחילה, כדי להשתמש בפונקציות ספירת FASTAptamer ואשכול FASTAptamer כדי לקבץ רצפים דומים לאשכולות.
לאחר מכן, השתמש בפונקציית ההעשרה FASTAptamer כדי לקבל מידע על העשרת רצפים ואשכולות. זהה את רצפי האפטמר המועמדים מתוך מידע ההעשרה המתקבל באמצעות ניתוח רצפים. בחר מספר רצפי אפטמר ובצע סינון ראשוני באמצעות בדיקת קשירה.
בניתוח זה, qPCR שימש כדי לעקוב אחר התקדמות SELEX של aptamers ספציפיים זיהומיות SARS-CoV-2. תשואת ה-elution עלתה בתחילה עם כל סבב של SELEX והתייצבה בסבבים שמונה ותשעה. על ידי השוואת עקומות ההיתוך, נצפה שינוי מהשיא בטמפרטורת התכה גבוהה מ-77 ל-79 מעלות צלזיוס.
יתר על כן, בשני הסבבים האחרונים נצפתה שיא בטמפרטורת התכה נמוכה. השפע היחסי בקריאות למיליון עבור הרצף SARS2 AR10 שהתקבל במהלך סבבי בחירה רצופים מוצג. המבנה החזוי של SARS2 AR10 הראה מבנה משני מובנה המכיל אזור לולאת גזע שעשוי להיות מעורב בזיהוי הנגיף.
לאחר קבלת אפטמרים, ניתן לשלב אותם באופטיקה חשמלית, סוג אחר של חיישנים, כדי לפתח פורטל ובדיקת זיהוי וירוסים מהירה שיכולה ליידע על הדבקת הנגיף. אנו רואים לנגד עינינו כי ניתן להשיג אפטמר ספציפי לווריאנטים שונים או סטריאוטיפים שונים של הנגיף, מה שיאפשר ניטור מהיר של וריאנטים שהם האיום הגדול ביותר על החברה.
