我们的协议使我们能够研究骨骼肌等组织如何调节其大小，这仍然是细胞和发育生物学中的一个关键问题，具有重要的生理和医学意义。我们技术的主要优点是可以在活体动物体内以高度的空间和时间精度观察和测量细胞生长。对早期肌肉生长的基本理解的进展可以突出早期肌肉问题的发育起源，并导致发现Novo Therapeutics，以防止老年人和肌肉萎缩障碍患者的肌肉流失。
在 1.5 毫升的管中准备 1%LMA，并将其保存在 37 摄氏度的加热块中以重复使用。选择要安装的鱼并暂时麻醉每条鱼。为避免热冲击，请从加热块中取出 LMA 等分试样，让它冷却到略高于设置水平。
取一个涂有一层1%LMA的60毫升培养皿，并将其放在解剖显微镜的载物台上。用一毫升塑料巴斯德移液管将幼虫转移到60毫米涂层的培养皿上，并尽可能多地去除转移的培养基。然后，仍然使用巴斯德移液管，将几滴LMA滴在鱼上，并在LMA凝固之前使用镊子或火抛光的细玻璃针快速将幼虫定向到LMA的上表面附近，其前后轴和背腹轴在水平面的10度以内。
或者，使用一毫升塑料巴斯德移液器。用最少的鱼培养基收集幼虫，并将幼虫转移到冷却的LMA的等分试样中。让幼虫下沉五秒钟，完全被LMA包围。
然后取回幼虫并将其在一滴LMA中转移到琼脂糖包被的培养皿上。如前所述快速定位幼虫。如果幼虫没有正确水平安装在琼脂糖滴的表面附近，移除并重新嵌入，则可以使用一毫升塑料巴斯德移液管轻轻抽吸，轻松取回幼虫，并且可以使用化学湿巾轻轻去除LMA。
等待大约 10 分钟，直到 LMA 设置。在盘子里倒入大约 10 毫升含三卡因的鱼培养基。要捕获共聚焦堆栈，请在扫描前让安装的鱼休息至少 10 分钟，因为会发生琼脂糖肿胀。
将样品皿加载到共聚焦系统的载物台上。找到幼虫并专注于所需的体细胞。可以选择 Somite 17，因为它易于定位在肛门通风口附近且易于成像。
通过计数前部的体细胞进行检查。要捕获 YZ 图像，请像捕获 Z 堆栈一样进行设置。首先定义鱼的顶部和底部。
可以根据需要捕获左侧和右侧，确保所有快速YZ扫描捕获所需区域。在共聚焦软件允许的情况下调整鱼的扫描区域。将鱼定位为前后轴，平行于图像 dex 轴和背腹轴平行于 Y 轴，体细胞 17 位于场的中心。
聚焦在最上层肌组的中层平面上，其中整个外轴和上轴体细胞的两半以及垂直和水平肌隔膜是可见的，并捕获高分辨率的XY图像。命名文件并保存图像。要捕获 YZ 图像，请在所选体细胞上绘制一条精确的背侧到腹侧线，垂直于鱼的前后轴。
添加选定的前后位置，然后执行 Z 堆栈线扫描。沿着选定的肌切片在定义的前后位置重复YZ线扫描三次，以捕获YZA，YZM和YZP。命名这些图像并将其与相关的 XY 图像一起保存。
该协议被称为四切片方法，可以使用Zen软件或ImageJ分析图像。要创建增产室，请取一个 6 x 35 毫米的孔板，并使用狭窄的烙铁在每个孔的每侧创建两个直径小于 5 毫米的小开口，每侧相距一厘米。一旦创建，刺激室可以重复使用。
将一对银线或铂金线穿过每个孔的开口。可重复使用的粘合剂材料可以涂在开口附近，以保持电线到位并确保电线之间的距离为一厘米。受精后3天，将鱼分成三种条件，鱼培养基对照，非活性和非活性加茎。
对于非活性和非活动加茎组，在受精后 72 小时用 0.6 毫摩尔三卡因麻醉幼虫。对于鱼培养基对照鱼，请让它们不麻醉。在鱼培养基中准备60毫升2%琼脂糖。
用微波炉彻底融化，让它冷却。然后加入三卡因，向增产室的每个孔中倒入至少四毫升。立即在电极之间添加定制的四孔梳。
等待 10 分钟让凝胶凝固。小心地取下梳子以创建四个矩形孔。用三卡因水填充每个孔，并使用微量移液管在每个孔中放置单个麻醉的，非活性的加茎幼虫，其前后通道垂直于电极。
在解剖荧光显微镜下检查每条鱼是否在每个腔室内完全麻醉。使用连接到腔室一侧每个电极的鳄鱼夹，通过极性控制器将可调节的电生理、模式生成刺激器连接到腔室。然后按照文本手稿中的描述刺激鱼。
定期在显微镜下检查，以确认鱼受到刺激。电刺激应根据所述参数每五秒引起一次可见的双边收缩和轻微运动。刺激后，用塑料移液管轻轻冲洗鱼，小心地从每个孔中取出鱼，然后在新鲜的含三卡因的鱼培养基中返回孵化器。
倒掉腔室内的三卡因水，用镊子切开并从每个孔中取出琼脂糖，用自来水冲洗孔并使其干燥。为了分析肌肉大小，称为四层法，获得了斑马鱼幼体肌肉的XY和YZ图像，并计算了体细胞体积。在四层和全栈法之间观察到很强的相关性，尽管四层法给出的体积估计略大。
对体细胞16和18的相邻肌组的体积分析显示，每个体细胞比后面的体细胞大约7%。进一步的研究表明，只需一次YZ测量的两层法就可以合理准确地估计肌切片体积。肌切片的长度和受精后2至5天的横截面积可检测地增长，导致体积稳步增加。
在受精后第三天和第四天之间，麻醉剂三卡因使肌肉不活动，体积显着减少，表明幼虫肌肉生长是活动依赖性的。与受精后三天和四天测量每条鱼相比，在受精后四天测量肌切片体积时观察到肌切片尺寸减小的变化更大。尽管如此，在两种肌切片测量方法之间没有观察到肌切片体积的显着差异。
对肌组内纤维数量的测量以及平均纤维体积表明，活动控制着生长的两个细胞方面。确保使用新鲜制备的三卡因完全麻醉幼虫。部分麻醉会导致不同的结果。
众所周知，幼虫对电刺激的反应更强烈。这种方法与下游转录组学和药理学实验相结合，揭示了力传感如何驱动骨骼肌生长的新见解。
