Questo metodo consentirà la caratterizzazione di diverse cellule immunitarie negli stessi stati di malattia di individui con IM, che amplierà la nostra comprensione del meccanismo dell'infezione da EBV. A dimostrare la procedura sarà Linlin Zhang, un medico del nostro laboratorio. Per iniziare, prendere i PBMC isolati in precedenza in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e ruotarli a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 80 microlitri del tampone preparato. Quindi, aggiungere 20 microlitri di microsfere CD 14 alla sospensione cellulare, mescolata bene mediante pipettaggio, e incubare il tubo per 15 minuti sul ghiaccio. Quindi lavare le PBMC utilizzando un millilitro di tampone e centrifugare a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Scartare l'intero surnatante e risospendere le cellule con 500 microlitri di tampone. Per la separazione magnetica, posizionare una colonna sul separatore di sfere magnetiche e innescare la colonna lavandola con tre millilitri di tampone. Quindi, aggiungere la sospensione della cella alla colonna.
Lasciarlo passare e raccogliere le cellule non etichettate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone e raccogliere l'intero effluente in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Ora, posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di tampone alla colonna.
Spingere saldamente lo stantuffo nella colonna per lavare le celle marcate magneticamente nel tubo. Centrifugare le celle marcate magneticamente a 300 G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per il successivo sequenziamento del trascrittoma.
Pellettare le cellule non etichettate raccolte centrifugando a 300 G per cinque minuti e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo marcato alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce. Successivamente, aliquote 100 microlitri della sospensione della cella PBMC in provette di microcentrifuga da 1,5 millilitri per impostare un campione di controllo negativo CD 3, CD 4, CD 8 e CD 19, campioni di colorazione singoli e un campione di colorazione CD 56 o CD 16.
Quindi aggiungere due microlitri del corrispondente anticorpo marcato con fluorescenza a ciascuna provetta e incubare sul ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare tutte le cellule con PBS come dimostrato in precedenza e risospendere in 500 microlitri di PBS. Aprire il sistema di ordinamento delle celle ed eseguire il programma di accensione.
Quindi, installare l'ugello da 85 micrometri e aprire il flusso di smistamento. Impostare la tensione di ordinamento su 4.500 volt e la frequenza su 47. Imposta lo spazio su 8 nella finestra di interruzione e attiva la modalità di ordinamento automatico del punto debole per determinare automaticamente il valore dell'ampiezza della goccia.
Infine, regola il ritardo delle gocce su 30,31 nella finestra del flusso laterale. Utilizzando un dot plot a dispersione in avanti rispetto a un lato, disegnare la porta poligonale P1 per identificare la popolazione di linfociti intatta. Successivamente, utilizzando un'area di dispersione diretta rispetto al grafico a punti di altezza, disegnare il gate poligonale P2 per identificare le singole celle ed escludere doppietti.
Quindi, utilizzando un'area FITC CD 19 rispetto a CD 3 per il grafico a punti dell'area CPCY 5.5, disegnare il gate rettangolare P3 per selezionare le celle T positive del CD 3 e le celle B positive del CD 19. Successivamente, utilizzando un'area APCCY 7 CD 4 rispetto al dot plot dell'area PE del CD 8, disegnare un gate rettangolare per selezionare le celle T positive CD 4 e CD 8. Infine, utilizzando un'area di dispersione laterale rispetto al diagramma di punti dell'area APC CD 56 o CD 16, disegnare un cancello rettangolare per selezionare le celle natural killer positive CD 56 o CD 16.
Per il tubo di controllo negativo, fare clic su Carica nel dashboard di acquisizione e selezionare le impostazioni del citometro nel software. Nella finestra di impostazioni, fare clic sulla scheda parametri e regolare le tensioni di dispersione diretta, dispersione laterale e coloranti fluorescenti diversi. Dopo aver caricato i singoli tubi colorati nel citometro, fare clic su Carica nel dashboard di acquisizione, quindi fare clic sulla scheda Compensazione per regolare la compensazione, come descritto nel testo.
Vortice la sospensione cellulare delicatamente, prima di caricare il tubo nel citometro. Aggiungere 200 microlitri di FBS a quattro tubi di flusso di raccolta e vortice i tubi. Posizionarli nella camera di raccolta del citometro.
Raccogliere i diversi tipi di celle separatamente nei quattro tubi di flusso. Ruotare le cellule separate a 300 G per cinque minuti e aggiungere 200 microlitri di reagente di isolamento dell'RNA alla tavolozza cellulare per il sequenziamento del trascrittoma. Nel presente studio, le sottopopolazioni di cellule immunitarie dal sangue periferico di diversi campioni sono state selezionate in modo efficiente combinando le tecniche delle perle immunomagnetiche e della selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza.
È importante sottolineare che in questo protocollo, la fase di ordinamento delle cellule è stata ottimizzata per migliorare la vitalità cellulare. Le cellule immunitarie selezionate hanno mostrato una maggiore percentuale di cellule T positive CD 3, CD 8 nei pazienti con mononucleosi infettiva rispetto sia ai portatori sani del virus Epstein-Barr che ai campioni non infetti. Al contrario, una diminuzione delle proporzioni di cellule T CD 3, CD 4 positive e cellule B CD 19 positive è stata osservata in pazienti con mononucleosi infettiva rispetto ai portatori sani di EBV e ai bambini non infetti da EBV.
Inoltre, sono state osservate percentuali ridotte di cellule natural killer CD 56 o CD 16 positive nei pazienti con mononucleosi infettiva rispetto ai bambini non infetti da EBV. Mantenere la vitalità cellulare è vitale per gli esperimenti successivi. Mantenere le celle sul ghiaccio o in frigorifero durante il processo di selezione è vantaggioso per la vitalità delle cellule.
