Diese Methode wird die Charakterisierung verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis des Mechanismus der EBV-Infektion erweitern wird. Linlin Zhang, eine Ärztin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Nehmen Sie zunächst die PBMCs, die zuvor in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen isoliert wurden, und drehen Sie sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 80 Mikrolitern des vorbereiteten Puffers. Als nächstes fügen Sie der Zellsuspension 20 Mikroliter CD 14-Mikrokügelchen hinzu, die durch Pipettieren gut gemischt werden, und inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis. Dann waschen Sie die PBMCs mit einem Milliliter Puffer und zentrifugieren Sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Verwerfen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern des Puffers. Für die magnetische Trennung legen Sie eine Säule auf den magnetischen Perlenabscheider und grundieren Sie die Säule, indem Sie sie mit drei Milliliter des Puffers waschen. Fügen Sie als Nächstes die Zellsuspension zur Spalte hinzu.
Lassen Sie es passieren und sammeln Sie die unmarkierten Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Milliliter Puffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie nun die Säule in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie der Säule fünf Milliliter Puffer hinzu.
Drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen in das Röhrchen zu spülen. Zentrifugieren Sie die magnetisch markierten Zellen bei 300 G fünf Minuten lang. Nach dem Entfernen des Überstands suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zur anschließenden Transkriptomsequenzierung.
Pelletieren Sie die gesammelten unmarkierten Zellen durch Zentrifugieren bei 300 G für fünf Minuten und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter jedes markierten Antikörpers zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht. Als nächstes aliquot 100 Mikroliter der PBMC-Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Negativkontrollprobe CD 3, CD 4, CD 8 und CD 19, einzelne Färbeproben und eine CD 56- oder CD 16-Färbeprobe einzurichten.
Dann fügen Sie zwei Mikroliter des entsprechenden fluoreszierend markierten Antikörpers zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht. Nach der Inkubation alle Zellen wie zuvor demonstriert mit PBS waschen und in 500 Mikrolitern PBS resuspendieren. Öffnen Sie das Zellsortiersystem, und führen Sie das Einschaltprogramm aus.
Installieren Sie dann die 85-Mikrometer-Düse und öffnen Sie den Sortierstrom. Stellen Sie die Sortierspannung auf 4.500 Volt und die Frequenz auf 47 ein. Stellen Sie den Spalt im Abbruchfenster auf 8 ein und aktivieren Sie den automatischen Sortiermodus für Sweet Spots, um den Tröpfchenamplitudenwert automatisch zu bestimmen.
Stellen Sie abschließend die Tröpfchenverzögerung im Seitenstromfenster auf 30,31 ein. Zeichnen Sie das Polygongatter P1 mithilfe eines Vorwärts- und Seitenstreupunktdiagramms, um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren. Zeichnen Sie anschließend mithilfe eines Punktdiagramms zwischen Vorwärtsstreufläche und Höhe das Polygongatter P2, um die einzelnen Zellen zu identifizieren und Dubletten auszuschließen.
Zeichnen Sie dann unter Verwendung eines CD 19 FITC-Bereichs im Vergleich zu CD 3 pro CPCY 5.5-Flächenpunktdiagramm das rechteckige Gate P3, um CD 3-positive T-Zellen und CD 19-positive B-Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie anschließend mithilfe eines CD 4 APCCY 7-Flächenpunktdiagramms im Vergleich zu CD 8 PE-Bereich ein rechteckiges Tor, um CD 4 und CD 8 positive T-Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie schließlich unter Verwendung eines Seitenstreubereichs im Vergleich zu CD 56- oder CD 16-APC-Flächenpunktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD 56- oder CD 16-positive natürliche Killerzellen auszuwählen.
Klicken Sie für das Negativkontrollröhrchen im Erfassungs-Dashboard auf Laden und wählen Sie die Zytometereinstellungen in der Software aus. Klicken Sie im Informationsfenster auf die Registerkarte "Parameter" und passen Sie die Spannungen der Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe an. Nachdem Sie die einzelnen gefärbten Röhrchen in das Zytometer geladen haben, klicken Sie im Erfassungs-Dashboard auf Laden und dann auf die Registerkarte Kompensation, um die Kompensation anzupassen, wie im Text beschrieben.
Wirbeln Sie die Zellsuspension sanft an, bevor Sie das Röhrchen in das Zytometer laden. Fügen Sie 200 Mikroliter FBS zu vier Sammelrohren hinzu und wirbeln Sie die Rohre durch. Legen Sie sie in die Zytometer-Sammelkammer.
Sammeln Sie die verschiedenen Zelltypen getrennt in den vier Durchflussrohren. Drehen Sie die getrennten Zellen bei 300 G für fünf Minuten herunter und fügen Sie der Zellpalette 200 Mikroliter RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomsequenzierung hinzu. In der vorliegenden Studie wurden Immunzellensubpopulationen aus peripherem Blut verschiedener Proben effizient aussortiert, indem die Techniken der immunmagnetischen Perlen und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung kombiniert wurden.
Wichtig in diesem Protokoll ist, dass der Zellsortierschritt optimiert wurde, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern. Die sortierten Immunzellen zeigten einen erhöhten Anteil an CD 3, CD 8 positiven T-Zellen bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu den gesunden Epstein-Barr-Virusträgern und nicht infizierten Proben. Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu gesunden EBV-Trägern und nicht infizierten EBV-infizierten Kindern verringerte Anteile von CD 3-, CD-4-positiven T-Zellen und CD-19-positiven B-Zellen beobachtet.
Darüber hinaus wurden bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu nicht infizierten EBV-Kindern verringerte Anteile an CD 56- oder CD 16-positiven natürlichen Killerzellen beobachtet. Die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist für nachfolgende Experimente von entscheidender Bedeutung. Das Aufbewahren von Zellen auf Eis oder im Kühlschrank während des Sortierprozesses ist vorteilhaft für die Zelllebensfähigkeit.
